1、721A型分光光度计使用、检查、实验、计算作业指导书编 制： 审 核： 批 准： 版 本 号: ESZAQDGF001 编 制： 审 核: 批 准： 发 布： 二XX年X月 721分光光度计的使用光的本质是电磁波。不同的光，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400-750nm，小于400nm的光线为紫外线，大于750nm的光线称为红外线。光线通过透明溶液介质时，一部分被吸收，一部分透过，因此光线射出溶液后光波部分减少。这种光波的吸收和透过可用于物质的定性定量分析。吸光分析依据的是Lambert和Beer定律。一、Lambert定律一束单色光通过透明溶液时，一部分的光波被吸收，2、被吸收光波的量与溶液厚度有一定比例关系。I = I0e-al式中I0为入射光强度I为通过溶液后的光强度l为溶液的径长e为自然对数的底，即2.718a为溶液的吸光率（1）式可改写为：ln（I0/I）= al(2)将（2）式换算成常用对数式，即log（I0/I）= 0.43al 令K = 0.43a 则log（I0/I）= Kl(3)此处以K为吸光率。二、Beer定律以溶液中溶质浓度变化代替溶液厚度的改变，光波的吸收与溶质浓度的改变有类同的关系。即一束单色光通过溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质浓度有一定比例关系。依据Lambert定律中同样的推导，可得出下式。log（I0/I）=3、 KC(4)式中c为溶液中溶质的浓度。Lambertp定律和Beer定律合并，即(3)和(4)式合并为log（I0/I）= KCl(5)令T =（I/I0） A = log（I0/I）则A = KCl(6)式中A为吸光度，T为透光度(6)式为Lembert-Beer定律的物理表示式，其含义为：一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，吸收多少与溶液中的溶质的浓度和溶液厚度成正比。此式为吸光分析法的基本计算式。三、721A型分光光度计仪器介绍目前科研和临床最常用的分光光度仪器（可见光区）是721分光光度计。721A型分光光度计采用自准式光路，单光束方法。光谱范围在360800nm。以钨丝灯泡为光源4、，经透镜聚光后射入单色器内，再经棱镜色散后，反射到准直镜，穿狭缝得到波长范围更窄的光波作为入射光，进入比色池透出的光波被光电管接受，产生光电流。经微电流放大器送至对数放大器，由对数放大器变换成常用对数值输出，再送至浓度调节器，数字面板表面通过切换开关分别选择微电流放大器的输出、对数放大器的常用对数输出及浓度调节器的输出信号进行透射比（T）、光密度（A）和浓度（C）的显示。下面分别简述仪器主要部件，并附“结构示意图”和“仪器外形图”。1.光源：以12V25W卤钨灯泡为光源。2.单色器组件：包括光缝片（园弧形的两片）、棱镜、准直镜、凸轮、波长盘、入射光与出射光调节部件等。是仪器的主要部件之一。3.5、试样xx（比色皿）：进光婧统龉饷娼杂晒庋瞥桑约跎俟獾纳洌殖置嫖煌腹獾拿壬蟮墓娓裎?SPANlang=EN-US0.5、1、2、3厘米4种。4.受光器：不是光电比色计的光电池而是光电管。它的阴极表面有一层对光灵敏的物质，光照射到光电管后，会发射出光电子，此光电子向阳极运动，形成光电流。光电管的灵敏度虽比光电池小，但经光电管出来的光电流可以放大，而经光电池出来的光电流不易放大，并且光电池易疲乏，故较高级的分光光度计均采用光电管作受光器。5.检测系统：包括对数放大器，浓度调节器和数字面板显示表。【实验准备】一、器材1.擦镜纸或棉花、滤纸片。2.1厘米的比色皿，铺有滤纸的表面皿或培养皿。3.220V交6、流电源，外接地线牢固。4、721A型分光光度计，配有仪器布罩。二、试剂1.蒸馏水或空白试剂（B）。2.不同浓度的同种颜色透明溶液两份，用作标准液（S）及待测液（U）。【实验操作】1.检查721A型分光光度计的旋钮和开关，使其回复零点。2.按要求接通电源，按下“T键”，打开暗盒盖和电源开关，指示灯亮。预热20分钟。3.调节波长旋钮至所需波长。4.取比色皿分别盛装B、S、U液，置入检测室（比色皿先用蒸馏水洗后，再用比色液润洗才能装比色液）。B液对准光路。5.调节面板“零位细调”，使指示为00.0，即透射比“T”的零点，同时“一”号闪跃。6.合下检测室盖.调节“光量粗、细调”电位器，使指示为100.7、0，须反复5、6两点操作达到稳定。7.按下“A”键，指示为“.000”同时“一”闪跃，如果指示读数不是比值时，应调节“消光调零“电位器，使其达到要求。8.拉出或推入拉杆，使U、S液分别置于光路读取A值，然后移动拉杆，读B管A值，如为0，则前述A值有效。9.在稳定时，重复读数一次，并按下“T”键。10.打开检测室盖，取出比色皿，倾去比色液于水槽中，用自来水冲洗干净，倒置于表面皿（铺有滤纸）中。11.关上电源开关，拔出电源插头，取出比色皿架，检查检测室内是否有液体溅出，并擦净。检测室内放入硅胶袋，合上盖，套上仪器罩。【计算】1.利用标准管计算测定物含量实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同8、样处理显色，读取吸光度，再根据（6）式计算，即A1= K1C1l1 A2= K2C2l2式中A1、A2分别为已知浓度标准和未知浓度测定吸光度。c1、c2分别为已知浓度标准管和未知浓度测定管中测定物浓度。因盛标准液和测定液的比色杯径长相同（l1=l2），故上二式可写成：A1/K1C1= A2/K2C2(7)因标准液和测定液中溶质为同一物，K值相同，即：（7）式可换算成下式：C2=（A2/A1）C1(8)因测定液和标准液在处理过程中体积相同，故（8）式可写成：m2 =（A2/A1）m1(9)式中m1、m2分别表示标准液和测定液中待测物的含量。（9）式为实验操作中常用计算式。2.利用标准曲线进行换算9、先配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度，以各管吸光度为纵轴，各管溶液浓度为横轴，在方格座标纸上作图得标准曲线。以后进行测定时，就无需再作标准管，以测定管吸光度从标准曲线上可求得测定物的浓度。一般认为，标准曲线范围在标准管测定物浓度的一半到二倍之间，并使吸光度在0.05-1.0范围内为宜。所作标准曲线仅供短期使用。标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，有时尽管型号相同，操作条件完全一样，因不是同一台仪器，其结果会有一定误差。3.利用摩尔吸光率求测定物浓度(6)式中K为吸光率，当浓度c为1mol/L，溶液厚度L为1cm时，则称为摩尔吸光率，以表示10、，此时与A相等。实际应用中测定物常以g/ml作浓度单位。已知情况下，读取测定液径长为1cm时的吸光度，根据下式可求出测定液的物质浓度。C = A/此计算式常用于紫外吸收法，如蛋白质溶液含量测定，因蛋白质在波长280nm下具有最大吸收峰，利用已知蛋白质在波长280nm时的克分子吸光率，再读取待测蛋白质溶液的吸光度，即可算出待测蛋白质的浓度，无需显色，操作简便。【注意事项】1.仪器须安放在稳固的工作台上，不能随意搬动。严防震动，潮湿和强光直射。2.盛装比色液时，约达比色皿体积，不宜过多或过少。若不慎使溶液流至比色皿外面须用棉花或拭镜纸擦干，才能放入比色架。拉比色杆时要轻，以防溶液溅出，腐蚀机械。311、.千万不可用手或滤纸等物摩擦比色皿的透光面。4.比色皿用后应立即用自来水冲洗干净，若不能洗净，用5%中性皂溶液或洗衣粉溶液浸泡，也可用新鲜配制的重铬酸钾洗液短时间浸泡，然后用水冲洗干净，倒置晾干。5.每套分光光度计上的比色皿和比色皿架不得随意更换。6.试管或试剂不得放置于仪器上，以防试剂溅出腐蚀机壳。7.如果试剂溅在仪器上，应立即用棉花或纱布擦干。8.测定溶液浓度的光密度值宜在0.10.7之间最符合光吸收定律，线性好，读数误差较小。如光密度超过0.11.0范围，可调节比色液浓度，适当稀释或加浓，再进行比色。9.合上检测室盖连续工作的时间不宜过长，以防光电管疲乏。每次读完比色架内的一组读数后，立即打开检测室盖。10.仪器连续使用不应超过2小时，必要时间歇半小时再用。11.测定未知液时，先作该溶液的吸收光谱曲线，再选择最大吸收峰的波长作为测定波长。12.721分光光度计的放大器暗盒及单色器箱处放有两个硅胶筒，检测室内放硅胶袋，应经常检查，发现硅胶变色，应更换新硅胶或烘干再用。13.仪器较长时间不使用，应定期通电、预热。14.仪器用完之后，须拔去电源，套上仪器罩。