1、微生物菌株保存、传代及销毁作业指导书编 制： 审 核： 批 准： 版 本 号: ESZAQDGF001 编 制： 审 核: 批 准： 发 布： 二XX年X月1.目的建立检定用菌种的管理制度，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。2 适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、传代、使用及销毁等。3 定义标准菌种是指由XX(XX)提供的冷冻干燥菌。传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使2、用的菌种。菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。4 职责4.1 技术主管负责菌种的申购、保存、分发。4.2 微生物检验员负责菌种的鉴定、传代、使用及销毁。5 程序或要求5.1 标准菌株的申购技术主管根据标准菌株的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），交由部门领导审批后，向XX购买冻干菌种（标准菌种），购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。5.2 标准菌株的接收菌种到达实验室后，由技术主管检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在标准菌株一览表上，内容包括：序号、标准菌株名称、标准3、号、级别、标识号、制造单位、有效期限，并将其暂贮存于48冰箱中。5.3 标准菌株的保存5.3.1 工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1 个月；酵母菌：2 个月；霉菌及芽胞：3 个月。5.3.2 传代用菌种的保存在无菌条件下，打开冻存管的螺旋瓶盖，用接种环挑取1824h新鲜细菌或霉菌纯培养物，放入冻存液中，拧紧瓶盖，来回颠倒使菌体乳化，配成34麦氏比浊度的菌悬液。此时菌悬液会吸4、附在小瓷珠内外表面，用无菌移液器将冻存管中的菌悬液尽量吸出，吸出的菌悬液应放入消毒液中并随后进行高压灭菌处理，拧紧瓶盖，-70冰箱中保存。填写标准储存菌株传代记录和菌株保存记录。5.4 标准菌株的传代标准菌株菌种的传代因是冻干菌（标准菌种）与传代用菌种而不完全相同。5.4.1 标准菌种的复苏、确认、传代5.4.1.1 标准菌种的复苏5.4.1.1.1 把冻干菌种管、微量移液器及吸头（1ml）、烧杯、镊子、无菌水、营养肉汤培养基数支，移入微生物室的超净工作台或生物安全柜。5.4.1.1.2 将冻干菌种管外壁用75%乙醇棉擦净，待干。点燃酒精灯，将标准菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌吸头5、吸取无菌水，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。5.4.1.1.3 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌烧杯内，另取1 支灭菌吸头，在火焰旁吸取营养肉汤培养基0.5mL，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，转移至45mL营养肉汤培养基并用一次性无菌吸管吸取几滴,将其滴到营养琼脂斜面内，根据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下2472 小时（细菌需要 2448 小时的培养物，酵母菌需要72 小时的培养物，形成孢子的微生物则宜保藏孢子，放线菌和丝状真菌则应培养710 天）。最后将所用过的物品及菌种管经高压灭菌（121，20min），并填写菌株复苏、划线记录和废6、液（物）处理记录。5.4.1.1.4 取出培养物，仔细观察液体培养基是否浑浊，浑浊说明菌种复活生长，若不浑浊，在将其作为无活菌生长的培养物丢弃以前，细菌应至少培养1 周以上，霉菌和酵母菌至少应培养2 周以上，并在丢弃之前应高压灭活处理（121，20min）。5.4.1.2 标准菌种的确认5.4.1.2.1 用无菌接种环取上述培养物划线接种到TSA培养基（细菌）或孟加拉红培养基（霉菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，每种菌划4 个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。然后在36下培养2天（细菌）；28下培养3天（霉菌和酵母菌）。培养后，首先观察其是否具7、有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。5.4.1.2.2 菌种的确认结果，记录在菌株鉴定记录上。5.4.1.3 标准菌种的传代5.4.1.3.1 按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的营养肉汤培养基内，称第1 代（G1），复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第2 代（G2）。5.4.1.3.2 菌种确认后，挑取平板上纯8、菌落于瓷珠保存管制成合适菌悬液（具体步骤参照5.3.2），作为标准储存菌种（G2），也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第3 代（W3）。5.4.1.3.3 将第2 代（G2）菌种管-70冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常检验，也可放置于4的冰箱中保存。5.4.1.3.4 取一支冷冻保存的第2 代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管第3 代（G3）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种，此仍为第3 代（W3）。5.4.1.3.5 将第3 代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的第29、 代（G2）菌种经高温灭活处理后丢弃。5.4.1.3.6 按上述规程操作，直至G4 转为W5 为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。5.4.1.3.7 当工作用菌种代数小于5 时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。5.4.2 传代用菌种的传代当无标准用菌种时，可从XX购买菌种作为传代用菌种，不需经过复溶增菌，但应划线接种确认。将购回无异常的传代用菌种（一般为第3 代），根据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种(为第4 代)，同时，结合菌种的代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液按“5.3.2”的方法制备储备10、菌株数支，作为传代用菌种（仍为第3 代）。5.4.3 工作用菌种的传代当工作用菌种代数小于5 时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。取在冰箱 4保存的工作用菌种用营养琼脂斜面传代，并将新传代的培养物替代原有的菌种，作为工作用菌种。也可取用瓷珠保存管保存的菌种，进行复苏，直接作为工作用菌种。细菌每1 个月传代一次；酵母菌每2 个月传代一次；霉菌及芽胞每3 个月传代一次。当超过5 代，须用传代用菌种传代。5.4.4 传代时注意无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丢失。同时实验人员也要采取有效的预防措施进行自我保护，如工作时必须穿工作服，佩带无菌手套，实验完成以后消毒实验进行的区域、实验仪11、器和器具。如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤，微生物学检验人员应立即向技术主管报告以便及时进行处理。5.4.5 传代后，按标准菌株的编号原则编号，并在每一支菌种管上贴上标签，标签内容包括：名称、标识号、代数、传代日期、操作人。交技术主管统一保管。同时及时填写标准菌种传代记录。5.5 标准菌株的编号采用字母加数字表示标识号：标识号代次传代日期顺序号菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c）、金黄色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢杆菌（B.s）、白色念珠菌（白假丝酵母）（C.a）、黑曲霉菌（A.n）；代数用一位带有下标数字的字母表示：传代用菌种用G 表示；工作用菌种用W 表示；如G3 表示传代用菌种第3 12、代；W3 表示工作用菌种第3 代。传代日期用6 位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。如2012 年1 月12 日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为：E.c-01-G3-120112-01。5.6 标准菌株的保管5.6.1 标准菌株设专人加双锁保管，并对所保存的菌种建立菌株保存记录。5.6.2 标准菌株的定期检查与鉴定在菌种的保存期间，工作日应每天检查保存菌种冰箱的温度、必要时检查菌种管的塞子是否松动，是否染杂菌等，并及时填写标准储存菌株观察记录，如有异常应及时处理。标准菌种在保存期内均应根据菌种的特性检查其纯度和生化特性，必要时染色镜检，每一年一次。若发现与原菌种变异较13、大，应重新分离、纯化、鉴定、再加以保存，并做好菌株确证记录。5.6.3 所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应。5.7 标准菌株的使用5.7.1微生物学检验人员从技术主管领取工作用菌种或传代用菌种，用于日常检验或验证试验，使用后及时填写标准菌株使用记录，以便追踪菌种使用历史。5.7.2 菌液的制备：将新鲜的斜面菌种培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为10-100cfu/ml的菌悬液，置于04冰箱冷藏，用于阳性对照实验，使用期一天，浓菌液放冰箱可保存一周。5.8标准菌株（废弃）的销毁5.8.1 下列情况的菌种或培养物或被污染的器具等，必须采14、用121、20min高压灭菌处理：a、新一代菌种制备成功后的上一代菌种；b、使用完后的菌种和带有标准菌种的器具和培养物；c、超过有效期的菌种；d、凡被污染、变异、可疑等异常情况菌种；e、其他应废弃的菌种。5.8.2 废弃菌种的销毁由微生物检验员提出申请，交技术主管批准后，进行灭活处理，并有其他人在场监督，并填写废液（物）处理记录。6 支持性文件仪器设备管理程序 BMSJ/CX-23仪器设备期间核查程序 BMSJ/CX-24量值溯源程序 BMSJ/CX-25标准物质（标准菌种）管理程序 BMSJ/CX-267 记录和表单标准物质（标准菌株）申购表 BMSJ/CX-26-ZJ-01标准菌株一览表 BMSJ/CX-26-ZJ-06菌株传代记录 BMSJ/CX-34-ZJ-01菌株确证记录 BMSJ/CX-34-JL-02菌株保存记录 BMSJ/CX-34-JL-03标准储存菌株观察记录 BMSJ/ZYZ-JX-01-JL-01菌株使用记录 BMSJ/ZYZ-JX-01-JL-02菌株复苏、划线记录 BMSJ/ZYZ-JX-01-JL-03废液（物）处理记录 BMSJ/CX-15-ZJ-05编制/日期： 审核/日期：XX/2014年11月10日 XX/2014年11月10日