1、生物科技有限公司项目投资建议书XX工程咨询有限公司二零XX年XX月XX项目可行性研究报告建设单位：XX建筑工程有限公司建设地点：XX省XX市编制单位：XX工程咨询有限公司20XX年XX月58可行性研究报告编制单位及编制人员名单项目编制单位：XX工程咨询有限公司资格等级： 级证书编号：（发证机关：中华人民共和国住房和城乡建设部制）编制人员： XXX高级工程师XXX高级工程师XXX高级工程师XXXX有限公司二XX年XX月XX日目录第一章 体外诊断试剂项目所处行业发展现状分析（2009-2011年数据）15第二章 体外诊断试剂技术情况分析15第一节 新型诊断试剂行业发展现状16第二节 监管部门及产业2、政策18第三节 我国体外诊断试剂行业利润水平及其变动趋势分析20第四节 新型诊断试剂行业同业竞争情况20第二章 新型诊断试剂技术情况分析21第一节 免疫诊断试剂地位221.项目技术现状242.项目主要研究内容(项目研究内容及涉及的关键技术及技术指标描述253.项目技术路线描述254.项目技术实现依据25第三节 胎膜早破体外诊断试剂盒竞争产品41第三章 “育宜康”诊断试剂项目所应用技术工艺47第一节：生产工艺调查47第四章 胎膜早破诊断试剂项目产成品市场调查50第一节 妇产科诊断试剂的市场策略50第二节 推广策略51区域专业学术会议推广53第四节 主要产品分类价格水平调查571.项目产品生产成本3、分析572.项目产品定价57A、定价策略57第五节 2013-2017年新型诊断试剂产品产销统计及预测57第五章 新型诊断试剂项目风险防控策略建议585.1财务分析585.2投资保障及相关安排63基本评估结论与投资建议基本评估结论 我国体外诊断试剂市场缺口巨大，年复合增长率将超过20%，全球诊断试剂市场规模近600亿美元，中国作为人口大国目前仅占3.8%市场份额，远远不能满足日益增长的临床精确诊断需求。目前外资诊断试剂牢牢占据了中国诊断试剂60%以上的市场份额，这些产品的价格是国产试剂的5-8倍。加快发展国内具有自主知识产权、技术水平处于国际同类领先水平的本土诊断试剂企业迫在眉睫。某某生物依托4、高新区的优质创业环境，引进国际知名专家，在体外诊断市场细分领域寻求突破，打造国际化妇产科体外诊断试剂供应商品牌，迅速占领市场份额，树立本土品牌企业形象，具有广阔的发展空间，也是国家重点扶持范畴。该项目具有以下投资亮点：1、符合免疫诊断试剂逐步替代60%以上生化诊断试剂市场份额的国内外临床精确诊断需求趋势，具有临床诊断价值，和用户需求；2、具有核心知识产权，技术优于国内同类产品，在国际上也处于领先水平，其快捷、准确的诊断信息为临床诊疗提供依据，也容易为素质高的孕产妇所熟知，有利于优生优育国策，关系民生，未来可能成为基础普查项目；3、其后续产品已经研发完成，有待预临床和进一步推广，产品形成阶梯式发5、展架构，未来有源源不断的造血功能，能够在体外诊断试剂领域树立品牌价值，形成集合效应。4、某某公司商业模式清晰、利润空间大，市场规模按年度成几何递增趋势，市场空间也在逐年放大，没有上限也不会缩减，随着生活水平提高，健康意识加强，将成为人们熟知的诊断方式被越来越广泛的应用； 5、某某公司所处领域尚属空白，且体外诊断试剂有技术、前置审批条件等壁垒，不容易进入，若能够快速占领市场，未来1-2年没有强有力的竞争者出现，容易在该领域确立领先地位。如何开拓市场仍是公司的主要难点，但该类产品符合市场趋势，具有临床实用价值，具有实际用户需求，通过一定公关手段能进入重点医院的采购目录，以点到面向全国二、三线城市辐6、射具备可行性。某某公司经营层和管理团队有过创业经验，公司设立初期在运营管理上比较规范，具有战略眼光，重视品牌定位和形象包装，理念领先于小型创业企业。综合评价而言，我们认为：某某公司符合国家政策导向和市场趋势，结合国内外技术成果，立足妇产科领域广阔市场前景，重视品牌宣传，在相对空白的市场领域迅速推广产品，其产品的认知度正逐步提高，市场局面打开虽然有待团队努力，但加以时间和有效的营销策略最终会实现突破式发展。符合天使投资项目多额基本条件，建议投资。投资建议建议投资额度200 万元，企业整体估值综合考量前期投入及未来可能的市场空间，以净利润折现计算为4000万元。但由于市场仍存在不确定风险，建议设置7、年度经营目标和净利润预测底线：2013年2014年2015年2016年2017年336672100813441680如果某某公司预测净利润未能完成，将按照实际完成数调整公司估值，从而调整本轮投资人持股比例；如果大股东不同意调整投资人持股比例，或者出现其他未披露风险发生（产品进入医院采购目录无法推进、后续产品推迟上市或影响小股东权益等），在投资协议中设置相关限制性条款，投资人有权要求控股大股东在违反限制性条款约定的前提下按原价回购该部分股权，以保障投资者权益。某某生物投资建议概要投资建议 建议对某某生物进行天使投资，投资额度200万元。投资主题某某生物市场巨大 某某生物在体外诊断试剂行业细分领域8、“妇产科用体外诊断试剂”需找突破口，自主研发了“育宜康”、“安宜康”等产品，在中国2000万孕产妇中，用户目标群体占30%左右。 我国体外诊断试剂市场正以每年20%增长率递增，其中基于免疫学原理的体外诊断试剂迅猛发展，正逐步替代传统生化检测方法成为主流，仅胎膜早破一项产品市场规模高于5亿元/年。 国外成熟的体外诊断试剂已有900多中，我国尚不到600中，仍有300多种技术路径成熟的产品未引入国内或在国内推广。其中具有自主知识产品并且优于国外同类产品的具有可观的商业机会。市场机会凸显，部分行业市场已形成明确需求 随着经济飞速发展，孕产妇年龄逐年增大，孕期监测，疾病诊断、各种并发症的防范已成为迫切9、要求。 目前现有的临床诊断技术相对落后，时间长、准确率低，大大延误了最佳治疗期，降低新生儿质量，给患者和医院带来困扰。 国家早已将疫苗和诊断试剂专项产业化纳入“十一五规划”，目前正积极推进孕产妇病理筛查进入公共卫生服务项目，可用于指导和规范现行检测途径。 随着生活水平的改善，家庭越来越重视科学孕育方法，目前许多产妇本身具有较高知识水平，重视知情权，愿意主动配合健康检查和常规诊断。某某生物产品特异性、灵敏度高，在国内处于领先地位，其产品通过临床验证可靠，具有推广价值 公司具有核心知识产权，其中发明专利5项，实用新型专利2项，国际专利3项。 通过6家三甲医院临床试验，结果显示某某生物“育宜康”的准10、确度为97.52%、特异度96.15%，灵敏度更高达99.53%，受到试点医院好评，初步建立合作意向，并同步向西南省市推广。 在国外文献和国内临床试验对比数据显示，某某生物胎膜早破产品的检测物sICAM-1优于IGFBP-1，用实践证明“育宜康”产品和技术的可靠性。 某某生物公司经过质量体系考核认证，并成功取得产品注册证，建立了10万级清洁生产车间，已经全部具备审批前置许可条件，和批量生产条件。项目风险防控策略建议1、 价格风险：相对传统检测方法，由于成本中前期市场开拓和研发投入，使得定价偏高。2、 销售风险：若无法进入医院销售目录，又不能采用直接面向消费者的策略，则会出现产品滞销。3、 政策11、风险：不能纳入社保范围的报销品种，则会大大降低使用率。4、 经营管理风险：直销为主，代理为辅的销售模式虽然有利于产品品牌建立和准确的用户定位，但也加大公司管理运营风险和成本。5、 财务风险：公司虽然有房产等固定资产，但负债率偏高，提示现金流紧张，前期投入较大，容易产生财务风险。6、 技术工艺风险：诊断试剂上游产品依靠外源，抗体源本身具有质量稳定性差异，生产工艺本身也要受到操作流程和质量监控影响。股权结构现状股东名称投资额（万元）占公司股份比例关祥乾62062%胡怀中38038%合计1000100%估值：鉴于市场启动时间的不确定性较大，建议将前5年预测净利润按40%IIR折现，按保守预测值计算投12、后估值为4000万元。孕产妇数量：20,000,000年发病率：14%每发病孕妇使用试纸：2潜在市场规模（条）5,600,000售价200潜在市场规模（元）1,120,000,000某某生物公司估值20132014201520162017市场份额5%10%15%20%25%出售数量280,000 560,000 840,000 1,120,000 1,400,000 营业收入56,000,000 112,000,000 168,000,000 224,000,000 280,000,000 营业成本（40%）22,400,000 44,800,000 67,200,000 89,600,00013、 112,000,000 销售费用(15%)8,400,000 16,800,000 25,200,000 33,600,000 42,000,000 管理费用(15%)8,400,000 16,800,000 25,200,000 33,600,000 42,000,000 财务费用(10%)5,600,000 11,200,000 16,800,000 22,400,000 28,000,000 营业利润11,200,000 22,400,000 33,600,000 44,800,000 56,000,000 所得税费用(25%)2,800,000 5,600,000 8,400,00014、 11,200,000 14,000,000 净利润8,400,000 16,800,000 25,200,000 33,600,000 42,000,000 折现率40%40%40%40%40%PV6,000,000 8,571,429 9,183,673 8,746,356 7,809,246 NPV40,310,704 大纲目录 第一章 体外诊断试剂项目所处行业发展现状分析（2009-2011年数据）第一节 体外诊断试剂行业发展现状第二节 监管部门及产业政策第三节 我国体外诊断试剂行业利润水平及其变动趋势分析第四节 体外诊断试剂行业同业竞争情况第二章 体外诊断试剂技术情况分析第一节 免疫15、诊断试剂地位第二节 胎膜早破体外诊断试剂盒（商品名：育宜康）2.1育宜康概况：2.2产品技术描述2.3创新性2.4关键技术点披露第三节 胎膜早破体外诊断试剂盒竞争产品第四节 子痫前期快速检测试剂盒（商品名：安宜康）第三章 新型诊断试剂项目所应用技术工艺及主体设备调查第四章 新型诊断试剂项目产品市场调查第一节 妇产科诊断试剂市场规模第二节 推广策略第三节 市场销售计划第四节 主要产品分类价格水平调查第五章 风险防范策略及财务尽职调查情况第一章 新型诊断试剂项目所处行业发展现状分析（2009-2011年数据）第一节 新型诊断试剂行业发展现状1.1 全球诊断试剂发展概况： 全球诊断试剂市场在同样经受16、世界经济危机冲击下，仍然保持了6%左右的增长，2011年全球诊断试剂市场为591亿美元，主要市场中北美占比42%、欧洲25%、日本10%，而中国仅占3.8%。远远低于中国医药市场在国际市场上9.8%的市场占比。 美国已经批准诊断试剂超过800个，但是相对于12000种疾病而言，诊断试剂的研发发展空间仍然巨大。而中国截至到2011年，批准诊断试剂只有580个。 发达国家，诊断试剂检查费用占临床医疗费用的3035%，中国相关占比仅为12%；中国目前人均诊断消费量仅为全球人均诊断消费量的17%。1.2 中国诊断试剂发展状况： 中国诊断试剂工业起步于20世纪80年代，经过多年的发展，尤其是最近5年在国17、家新医保改革和预防优先的健康政策影响下，中国诊断试剂取得了快速发展。2011年诊断试剂市场达到146亿元人民币。预计未来5年，年复合增长率将超过20% 目前中国有医院18000家、3600家卫生院、300家血站、200家疾控中心、数以千计的体检中心和数百家独立诊断实验室，但是上述医疗机构中，尤其是中低端医疗机构多数检验体系不健全。随着医疗诊断需求的不断扩大，尤其是国家新医改方案中关于提高县级以下医院诊断人数，实现预防为主的防治目标的要求推动下，未来数年内诊断试剂需求缺口巨大。外资诊断试剂依靠质量稳定、技术含量高及高效、精确仪器配套，牢牢占据了中国诊断试剂60%以上的市场份额，尤其是在三级医院等18、高端医疗市场上占据着垄断地位，这些产品的价格是国产试剂的5-8倍。因此，中国国产诊断试剂实际市场金额只有58亿元左右。 近五年来，随着中国在生物技术领域的快速发展，大量具有很高科研开发能力的研究人员带着开发成果回国创建创新性诊断试剂公司，没在一定程度上提升了国产诊断试剂的水平。但是由于这些公司多数属于研发导向，研发思路简单、产品单一，无法保证公司长期盈利能力和后续研发能力 因此，国内诊断试剂公司不断推出创新性产品，寻求研发领先是在市场竞争中逐渐摆脱劣势的必经之路。1.3 中国诊断试剂发展方向 高度集成、自动化的新仪器平台诊断-为高端医疗单位提供高通量、高灵敏度、高准确性和快捷的疾病诊断方案。 19、简捷、快速、适合普及的快速诊断试剂盒为中低端医疗单位和社区建立健全检验体系提供快捷、准确的诊断方案 专业的诊断试剂推广和学术合作团队-在创新性产品不断推出的情况，建立生产者和使用者之间的桥梁，推动新观念普及、扩大临床和社会的诊断需求，建立通畅市场和研发的反馈体系。 第二节 监管部门及产业政策2.1 审批流程图2.2 相关管理办法国家食品药品监督管理局关于印发体外诊断试剂注册管理办法（试行）的通知国食药监械2007230号国家食品药品监督管理局体外诊断试剂生产实施细则（试行）附：不同洁净级别生产区域的控制标准洁净度级别尘粒最大允许数/立方米微生物最大允许数0.5m5m沉降菌数/皿100级3,5020、00110,000级350,0002,0003100,000级3,500,00020,00010企业应当明确工艺所需的空气净化级别，进入洁净室(区)的空气必须净化。附： 参考文献GBT 19000-2000 质量管理体系 基础和术语；GBT 19001-2000 质量管理体系 要求GBT 19001-2003 质量和（或）环境管理体系审核指南；GBT 19023-2003 质量管理体系文件指南；YY 0033-2000 无菌医疗器具生产管理规范YYT 0316-2003 医疗器械 风险管理对医疗器械的应用YYT 0287-2003 医疗器械 质量管理体系 用于法规的要求YYT 0467-20021、3 医疗器械 保障医疗器械安全和性能公认基本原则的标准选安全认可准则国家药品监督管理局第22号令医疗器械生产质量体系考核办法中国生物制品规程2000；药品生产质量管理规范1998修订；国家食品药品监督管理局第16号令医疗器械注册管理办法医疗器械生产企业质量管理体系规范（草案） 中华人民共和国国务院令第424号病原微生物实验室生物安全管理条例实验室生物安全认可准则2.3 行业相关扶植政策第三节 我国体外诊断试剂行业利润水平及其变动趋势分析体外诊断试剂行业属于高技术行业，整体利润水平较高，企业综合毛利率一般在 55%以上，新产品上市后 23 年即可收回投资，特别是具有技术垄断优势的新产品，利润回报22、更高。此外，行业具有规模经济特征，大批量品种盈利能力强，小批量品种往往亏损。目前我国体外诊断试剂市场集中度不高，行业内还存在大量中小型规模企业，随着国家对行业准入和产品质量要求的进一步提升以及国外领先企业对我国市场开拓的重视，技术含量低、生产规模小的企业将逐渐退出，技术创新能力强、生产规模大的优势企业则将获得更高的市场份额以及更高的利润水平。图表 Error! Bookmark not defined. 2008-2010 年我国体外诊断试剂行业内上市公司综合毛利率情况u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商公司名称u57中国行业咨询网_行业报告_行业23、分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商2008年度u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商2009年度u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商2010年度u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商达安基因（002030）u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商63.65%u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商58.29%u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市24、场数据和调查报告提供商58.68%u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商科华生物（002022）u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商60.95%u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商57.16%u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商53.92%u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商中生北控（8247.HK）u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调25、查报告提供商67.47%u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商67.62%u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商64.79%u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商同行业上市公司平均毛利率u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商64.02%u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商61.02%u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商59.13%26、u57中国行业咨询网_行业报告_行业分析_市场调研_第三方市场数据和调查报告提供商第四节 新型诊断试剂行业同业竞争情况4.1 本行业企业数量截止到2011年，中国拥有诊断试剂公司460家。这些公司特点：数量多、规模小、技术水平弱，创新性产品少。4.2 中国主要的诊断试剂种类和厂家一览表 品种 主要厂家 与乙型肝炎病毒检测相关的试剂盒 北京万泰、艾康、厦门新创、北京希波、郑州博赛、上海阿尔法、北京耀华、上海浩源、广州蓝星、华美生物、复星实业、上海明华、上海宏锦、上海科华、厦门安普利、上海申友、深圳匹基、深圳达尔安、爱恩地蓝 与丙型肝炎病毒检测相关的试剂盒 深圳匹基、上海复华、华美生物、上海科华、27、北京医大肝病所、中山生物、上海飞龙、北京万泰、上海永华、兰州蓝十字、深圳月亮湾、郑州百纳、沈阳惠民、北京现代高达、北京耀华 与结核分支杆菌检测相关的试剂盒 华美生物、上海宏锦、深圳匹基、上海万达、广州蓝星、深圳达尔安、复星实业、厦门安普利、上海奥普 与淋球菌检测相关的试剂盒 上海宏锦、上海申友 与梅毒螺旋体检测相关的试剂盒 上海万兴、爱德生物/北京蓝十字、北京耀华、华美生物、北京和新康、艾康、上海科华、吉比爱、丽珠试剂、北京金豪、北京万泰、厦门新创、中山生物、东瓯生物、北京金伟凯、北京现代高达、沈阳百奥、兰州生物制品所、上海荣盛 与人类免疫缺陷病毒检测相关的试剂盒 厦门新创、上海科华、成都生物28、制品所、中山生物、吉比爱、北京优耐特、丽珠试剂、华美生物、北京万泰、北京金豪、武汉生物制品所、北京阜金焱、杭州澳亚、中检所 与沙眼衣原体检测相关的试剂盒 深圳匹基、复星实业、上海宏锦、上海万达、广州蓝星、华美生物、上海申友、厦门安普利、深圳达尔安 与幽门螺杆菌检测相关的试剂盒 协和药业、山东潍坊医药、预防医学院科技服务公司、西安联尔、北京贝尔、上海晶莹 第二章 新型诊断试剂技术情况分析第一节 免疫诊断试剂地位 体外诊断试剂主要包括生化诊断试剂、免疫诊断试剂和分子诊断试剂三大类: 生化诊断试剂作为目前使用最为广泛诊试剂，以其简便、价廉被临床和实验室大量使用，包括常用的两对半、血糖等等。但是由于其29、特异性差，无法满足日益增长的临床精确诊断要求的需要。 免疫诊断试剂是目前性价比最高的试剂，种类也最多。由于其精确性和特异性高，得到市场的欢迎。但是这类产品良莠不齐，很多产品具有操作不方便、敏感性差、反应时间长等缺陷。价格相对较高，让这类试剂暂时无法全部覆盖中低端市场。如果这类试剂降低操作难度、降低价格门槛，提高质量稳定性，将会取代大多数的生化试剂市场。分子检测试剂是近3年来逐渐推广开来的检测手段，增长很快，通过PCR等，提高了灵敏度和反应速度，不仅定性而且定量。但是这类技术需要高昂的仪器设备，投入大，暂时无法普及到中低端市场。 第二节 胎膜早破体外诊断试剂盒（商品名：育宜康）妊娠期妇女可溶性细30、胞间粘附分子-1检测试剂盒（胶体金法）2.1育宜康概况：胎膜破裂（Rupture of Fetal Membrane，简称ROM）可能在孕期随时发生：在足月后（37孕周）、临产前发生的胎膜破裂称为胎膜早破（PROM），发生率约为14%。胎膜早破是引起产科病人产前、产后并发症的主要因素，是导致胎儿早产和新生儿必须入住重症监护室的主要原因。据统计，PROM是当今产科临床遇到的最为棘手的治疗难点之一。由于医务人员不得不在延长孕周与宫内及孕妇感染的风险和胎儿肺发育问题之间求平衡，所以对胎膜早破患者的管理成本高、难度大。现有技术中，羊水染色法可准确诊断胎膜早破，即在孕妇羊膜腔内注入染料(如美蓝)，若阴道31、内有被染料着色的液体流出可诊断为胎膜早破，但采用该方法检测临床很难操作，并且造成患者的痛苦，故临床很少使用。临床上通常采用询问病史、患者自诉阴道有羊水流出、阴道分泌物 pH 值变为偏碱性（正常阴道分泌物pH 为4.55.5 ,而羊水pH值为7.07.5 ）、显微镜下查见阴道分泌物涂片中出现羊水结晶等方法，这些方法虽然操作简单，但准确性、敏感性均较低。孕妇在妊娠期发生胎膜破裂，羊水中含量很高的蛋白分子将随着羊水的渗漏进入到孕妇的阴道分泌物中，其含量可能远远高于阴道分泌物中该蛋白分子的背景浓度。该项目产品技术创新在于：通过蛋白芯片技术对孕妇的羊水和阴道分泌物的蛋白谱进行分析，筛选出具有诊断意义的生32、物标志物用于胎膜早破的诊断研究。大大提高了胎膜破裂检测的准确性、敏感性。该项目产品为妊娠期妇女可溶性细胞间粘附分子-1检测试剂盒（胶体金法）（商品名：育宜康）用于妊娠期妇女胎膜早破的体外诊断。与原有的诊断技术相比本产品具有快速、准确、及时、安全等特点。2.2产品技术描述1.项目技术现状胎膜破裂（Rupture of Fetal Membrane，简称ROM）可能在孕期随时发生：在足月后（37孕周）、临产前发生的胎膜破裂称为胎膜早破（PROM），发生率约为10%。胎膜早破是引起产科病人产前、产后并发症的主要因素，是导致胎儿早产和新生儿必须入住重症监护室的主要原因。据统计，PROM是当今产科临床遇33、到的最为棘手的治疗难点之一。由于医务人员不得不在延长孕周与宫内及孕妇感染的风险和胎儿肺发育问题之间求平衡，所以，对胎膜早破患者的管理成本高、难度大。因此，准确及时诊断孕妇是否发生胎膜早破至关重要。现有技术中，羊水染色法可准确诊断胎膜早破，即在孕妇羊膜腔内注入染料(如美蓝)，若阴道内有被染料着色的液体流出可诊断为胎膜早破，但采用该方法检测临床很难操作，并且造成患者的痛苦，故临床很少使用。临床上通常采用询问病史、患者自诉阴道有羊水流出、阴道分泌物 pH 值变为偏碱性（正常阴道分泌物pH 为4.55.5 ,而羊水pH值为7.07.5 ）、显微镜下查见阴道分泌物涂片中出现羊水结晶等方法，这些方法虽然操34、作简单，但准确性、敏感性均较低。蛋白组学的研究进展和新技术的出现为我们研究妊娠期妇女的羊水蛋白谱，以寻找胎膜早破的生物标志物提供了新的方法，本项目拟运用先进的蛋白芯片技术为筛选胎膜早破的生物标志物提供依据。基于上述分析，我们拟开展以下研究：收集华西第二医院的入院病人，根据临床时的情况分为胎膜早破组、未破膜组与可疑组。收集生产时的阴道分泌物。选择典型的胎膜早破组与未破膜组生产时的阴道分泌物样本，用蛋白芯片技术筛选胎膜早破的生物标志物；用ELISA技术检测筛选出的生物标志物分子在各组研究对象的阴道分泌物中的含量。研制胎膜早破的金标快速检测试纸，建立相关免疫学检测方法。2.项目主要研究内容(项目研究35、内容及涉及的关键技术及技术指标描述收集华西第二医院的入院病人，根据临床时的情况分为胎膜早破组、未破膜组与可疑组。收集生产时的阴道分泌物，并建立相应的病例档案，详细记录研究对象的临床信息。选择典型的胎膜早破组与未破膜组生产时的阴道分泌物样本，用蛋白芯片技术筛选胎膜早破的生物标志物用ELISA技术检测筛选出的生物标志物分子在各组研究对象的阴道分泌物中的含量。数据整理与统计分析研制胎膜早破的金标快速检测试纸，建立相关免疫学检测方法3.项目技术路线描述收集华西第二医院的入院病人，根据临床时的情况分为胎膜早破组、未破膜组与可疑组。收集生产时的阴道分泌物，并建立相应的病例档案，详细记录研究对象的临床信息。36、选择典型的胎膜早破组与未破膜组生产时的阴道分泌物样本，用蛋白芯片技术筛选胎膜早破的生物标志物用ELISA技术检测筛选出的生物标志物分子在各组研究对象的阴道分泌物中的含量。数据整理与统计分析：利用 SPSS11.0（Statistical Package for the Social Sciences，社会科学统计软件包）进行统计分析，分析各组之间的差异是否具有统计学意义。研制胎膜早破的金标快速检测试纸，建立相关免疫学检测方法。4.项目技术实现依据设计思想依据（包括文献，或专利，或发明等）本项目的设计思想为：若孕妇在妊娠期发生胎膜破裂，羊水中含量很高的蛋白分子将随着羊水的渗漏进入到孕妇的阴道分泌37、物中，其含量可能远远高于阴道分泌物中该蛋白分子的背景浓度，因此，通过蛋白芯片技术对孕妇的羊水和阴道分泌物的蛋白谱进行分析，可能会筛选出具有诊断意义的生物标志物用于胎膜早破的诊断研究。关键技术实现的依据A、本课题组在前期工作中，已收集部分入院病人生产时的羊水与阴道分泌物，对这些样本的预试结果发现：生产时的羊水中有多种蛋白分子的蛋白印迹信号强于阴道分泌物。因此，前期研究结果提示我们十分有必要进一步深入研究。B、申请者具有多年在医药企业工作的经验，在实验室工作、工厂建设、产品研发、中试、大生产、以及项目申报等方面均积累了比较丰富的经验，到过国内多家药厂，和国内外医药行业专家学者保持有良好的关系。具有38、良好的科研思维，对本课题所需采用的技术与实验方法均非常熟悉。C、项目组主要成员主要从事分子生物学及免疫学研究工作。D、本项目组已具备开展研究工作的设备、空间和人员技术条件。 项目技术实现主要面临的风险及应对措施本项目实施的最大风险是妊娠期妇女的羊水与阴道分泌物蛋白谱没有差异。本课题组在前期工作中，已收集部分入院病人生产时的羊水与阴道分泌物，对这些样本的预试结果发现：生产时的羊水中有多种蛋白分子的蛋白印迹信号强于阴道分泌物。因此，前期研究结果提示我们十分有必要进一步深入研究。2.3产品技术创新性1、创新性原理：蛋白组学的研究进展和新技术的出现为研究妊娠期妇女的羊水蛋白谱，以寻找胎膜早破的生物标志39、物提供了新的方法，本项目拟运用先进的蛋白芯片技术为筛选胎膜早破的生物标志物提供依据。该项目产品技术创新在于：通过蛋白芯片技术对孕妇的羊水和阴道分泌物的蛋白谱进行分析，筛选出具有诊断意义的生物标志物用于胎膜早破的诊断研究。大大提高了胎膜破裂检测的准确性、敏感性。该产品主要采用胶体金免疫层析技术等对孕妇阴道分泌物的ICAM-1进行检测。项目产品应满足：测定浓度为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的可溶性细胞间粘附分子-1阳性参考品，结果应为阳性。测定浓度为1ng/ml的可溶性细胞间粘附分子-1阴性参考品，结果应为阴性。测定2ng/ml的可溶性细胞间粘附分子-1阳性参考品，平行检测10次，其40、反应结果应一致，为阳性。用含可溶性细胞间粘附分子-1的参考品检测，最低检出量应不高于2ng/ml。37放置20天。根据“四川省科学技术信息研究所”2011年5月25日出具的科技查新报告，编号：显示：国内外未见采用胶体金法，定性体外检测孕妇阴道分泌物中可溶性细胞间粘附分子-1，以判断妊娠期妇女是否发生胎膜破裂的文献报道。2、自有知识产权情况： A、（3项国内发明专利）发明专利：以Axl为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及制备方法2010.6.2 专利申请受理通知书 专利号：201010189639.0发明专利：以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及制备方法 2010.6.2 专利申请受理通知41、书 专利号：201010189663.4发明专利：以ICAM-1为检测指标的胎膜早破快速检测工具与检测盒2010.6.2 专利申请受理通知书 专利号：201010189683.1B、（1项国际专利）其中专利:以ICAM-1为检测指标的胎膜早破快速检测工具与检测盒2011.5.20 PCT国际专利申请已经受理，在2012年12月2日之前办理进入国家阶段的各种手续。 C、（1项实用新型专利）其中专利:以ICAM-1为检测指标的胎膜早破快速检测工具与检测盒 2011年1月5日 取得实用新型专利证书2.4关键技术点披露1、免疫学分析：免疫学分析是一种用抗体作为检测试剂的分析测定系统。抗体是一种从动物血42、清中分离得到的特异性蛋白，它可特异性地结合于诱导它们产物的底物，即抗原。抗体的制备是通过将待检测的底物将具有抗性的蛋白注射到动物如兔子或者老鼠体内，然后动物体内的细胞会将此底物识别为外来物质并产生抗体与之对抗。抗体经过纯化，并用可检测的标记与之连接，然后可作为检测目标底物的试剂。 免疫学检测方法发展和应用的先决条件是：得到可直接和待检测新蛋白作用的高特异性抗体。另外，目标样品或蛋白不能有明显的降解。 在对复杂基质中的抗原进行定量的检测中，抗体是一个很有用的生物学工具。所有的免疫学分析都是基于抗原和抗体之间的特异性结合。A:抗体-抗原相互作用 当免疫学家将抗体的本质确定为蛋白质时，对于抗体的大多43、数描述都包括：这些分子具有将抗原从溶液中沉淀出来的能力，尽管现在抗体沉淀性质已经很少用于实验性分离和检测抗原，除了在一些自身免疫疾病中抗体也很少在体内沉淀抗原。抗体沉淀反应的作用，如图 1 所示，地说明了抗体分子基本和普遍的特性。这个实验同时说明了其他的一些问题： 血清抗体 (IgG) 在与抗原反应时是二价的，它与抗原可以发生交联 (cross-link)； 抗原与抗体反应时一般是多价的；血清抗体在自然情况下都以多克隆形式存在； 抗体可以高度特异性地识别抗原分子的结构。 图 1. 单抗原及其抗体系统的沉淀曲线 以抗体沉淀量和逐渐增加的抗原浓度 (抗体总量恒定) 作沉淀曲线，可分为 3 个区域 44、(图 1) ： “抗体过量区”，在这个区域，抗体沉淀被抑制，可在上清液中检测到过量的抗体。 “等价区”，在这个区域，沉淀量达到最大，抗原抗体形成大的不溶性抗原抗体复合物 (蓝色显示)，上清液中检测不到抗原和抗体的存在。 抗原抗体沉淀反应能很好地描述多克隆抗体和多价抗原之间的相互作用，但一般地，它不适合于描述抗原和单克隆抗体之间的相互作用，除非抗原表现出多种一致的抗原决定簇 (如，在多糖中发现的重复碳架结构)，只有在这时，特异性的单克隆抗体才能交联并沉淀抗原。尽管如此，单克隆抗体有更简练的方法来描述其生物学特征，这些方法提供了关于抗体抗原相互作用的一些详细信息，如平衡常数和动力学开关速率。 抗体45、能非常有效的用来检测和分离抗原。化学修饰可以改变抗体的结构但是不破坏它们与抗原结合的能力，使得抗体的相对稳定性增强，从而使抗体的应用也大大加强。抗体可以通过化学方法，用荧光、磁性、放射性或其它化合物进行标记，使其在不同的实验条件下实现对抗原的检测和分离。 如何制备单克隆抗体抗原对于人体来说是外源物质，如致病性细菌和病毒，以及其它侵染性物质，它们可被人体的免疫系统作为入侵者而被识别。抗体是我们体内抵御这些侵染性物质的天然防线，可以识别抗原并有助于破坏抗原蛋白。 抗体非常有用的两个性质是，首先，它们是高度特异的；即每个抗体只能特异地结合和攻击一个特定的抗原。其次，有些抗体一旦被一种疾病激活，它将持46、续对这种疾病产生抗性。 利用抗体的第二个特点就可以发展疫苗。疫苗是一种弱化或者灭活的细菌或病毒，当它们被接种到人体中时，可以激活人体产生抗体抵御它所携带的抗原。 抗体的特异性使单克隆抗体技术变得价值非凡。抗体不仅仅可以用于医疗，抵御疾病；它们也可以帮助诊断一系列的疾病，检测药物、病毒和细菌产物、以及血液中其它不常见或不正常的物质。 由于这种抗病物质 (即抗体) 的多样化使用，抗体的纯化质量一直以来都是科学研究所关注的焦点。抗体制备传统的方法是向实验动物注射抗原，等抗体形成后，从动物的血清中回收抗体 (含有血清的抗体称为抗血清)。这种制备方法存在两个问题：它产生的抗血清中包含有其它一些不需要的物47、质，而且这种方法所产生的抗体的量是非常少的。 通过使用一种能在自然条件下产生抗体的细胞，和一类在培养条件下可以持续生长的细胞，单克隆抗体技术可以产生大量的高纯度的抗体。如果我们能将这种“不死”的特性，和这种可以产生我们需要的抗体物质的特性结合起来，实际上，我们就得到了一个连续工作的生产抗体的工厂。 在单克隆抗体技术中，有连续繁殖能力的肿瘤细胞，和产生抗体的哺乳动物细胞融合。这种融合细胞称为“杂交瘤细胞”，它可持续产生抗体。因为它们都是来源于同一类型的细胞-杂交瘤细胞，这些抗体就被称为单克隆抗体；另一方面，由传统方法产生的抗体是来源于多种类型的细胞，因此它们称为多克隆抗体。下边介绍一个单克隆抗体48、制备的例子。 B: 单克隆抗体的制备骨髓瘤细胞是一种骨髓中的肿瘤细胞，它可以在细胞培养中不停的生长。当骨髓瘤细胞和产生抗体的哺乳动物脾细胞融合，其结果产生杂交的细胞，称为杂交瘤细胞，它可以产生大量的单克隆抗体。这种细胞融合的产物集合了两个不同类型细胞的特性：持续生长的能力和产生大量高纯度抗体的能力。 因为选择性的杂交细胞只产生一种特异性抗体，其纯度比传统方法产生的多克隆抗体高很多。在对抗疾病方面，它们与传统的药物相比具有更高效的潜力，因为药物不仅攻击外来物质，同时也会攻击人体自身的细胞，有时也产生一些不期望的副作用如过敏反应。3、酶联免疫吸附分析 (ELISA) 技术酶联免疫吸附分析 (Enz49、yme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 是指：应用一个酶标记的免疫反应物 (抗原或抗体) 和一个免疫吸附剂 (结合在固体支持物上抗原或抗体)的酶免疫分析，通过不同的方法 (如：在标记的反应物和未标记的未知样品之间的竞争结合)，可用于测定未知样品的浓度。 ELISA (Clark and Adams，1977) 依赖于抗原抗体之间的特异性反应。ELISA 中的关键试剂是抗体，它是免疫系统应答于外来物质 (抗原) 侵染而产生的一种可溶性蛋白。对于转基因的检测，抗原则是新产生的蛋白。 至今，商业化的能够直接应用于批准的转基因作物插入基因蛋白产物的特异性抗体还很少50、：有一些抗体是针对于 nptII 基因产物 NPTII 或 APH (3) II，和针对 gus 基因的产物。此方法的建立是基于 CP4-EPSPS (5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，此酶来源于Agrobacterium sp.strain CP4) (Padgette et al.,1995) 蛋白特异性抗体的使用。CP4-EPSPS 蛋白赋予 Roundup Ready。初步结果表明，此方法 (操作中使用商业化的 ELISA 试剂盒) 可以检测基因成分含量范围在 0.3%到 5%之间。 原理 下图表示的是用于检测 CP4-EPSPS 蛋白的三明治式 ELISA 示意图：洗脱之后，加入一51、种与辣根过氧化物酶 (HRP) 共价偶联的多克隆抗体，该抗体可与CP4 EPSPS 蛋白的另一个抗原位点特异结合洗脱后，加入辣根过氧化物酶的显色底物四甲基联苯胺 (TMB)。辣根过氧化物酶可催化底物产生颜色反应，颜色信号与抗原浓度在线性范围内呈一定的比例。显色一定时间后，加入终止液终止反应。在 450 nm 波长处测量每一孔的光密度。4、蛋白质芯片；生物芯片；应用 生物芯片(Biochip)主要是指通过微细加工工艺在固体芯片表面构建的微型化学分析系统，从而实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确快速与大信息量的检测。其反应结果可用同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密52、的扫描仪或CCD(charge-coupled device)摄像技术记录，最后通过计算机进行数据处理以得到综合的信息。常用的生物芯片分为三大类：基因芯片(Genechip，DNA chip，DNA microarray)、蛋白质芯片(Proteinchip)、芯片实验室(1ab-on-a-chip)。 人类基因组(genome)排序工作的完成是人类医学史上的里程碑。基因芯片虽可在mRNA水平上分析整个基因组表达的情况，并得到了迅猛发展，但生命活动的主体是人体内存在的1O万种以上的蛋白质，发展蛋白质芯片这一高新技术已成为生物芯片领域的挑战性课题。 l 蛋白质芯片的发展概况 蛋白质能直接反映基因53、携带的遗传信息，它的功能一旦出现异常就可能引起疾病，破坏人体健康。如Alzheimers病人脑脊液中微量 淀粉样蛋白肽的出现b 是目前公认的脑神经退行性变的标志物。蛋白芯片可以将数十万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上，对抗原活体细胞和组织进行测试分析，同时蛋白质芯片的特异性高，亲和力强，受其他杂质的影响较小，因此对生物样品的要求较低，可简化样品的前处理，甚至可以直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测。 蛋白质芯片是指固定于支持介质上的蛋白质构成的微阵列。又称蛋白质微阵列(Protein miogrorray)，最早是在生物功能基因组学研究中继基因芯片之后，作为基因芯片54、功能的补充发展起来的。是在一个基因芯片大小的载体上，按使用目的的不同，点布相同或不同种类的蛋白质，然后再用标记了荧光染料的蛋白质结合，扫描仪上读出荧光强弱，计算机分析出样本结果。最早进行蛋白质芯片研究的是德国科学家Lueking。目前，国内也有学者在从事蛋白芯片的研究。 2 蛋白质芯片的原理 蛋白芯片技术的研究对象是蛋白质，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析55、；它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列。体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供有力的技术支持 。 21 固体芯片的构建 常用的材质有玻片、硅、云母及各种膜片等。理想的裁体表面是渗透滤膜(如硝酸纤维素膜)或包被了不同试剂(如多聚赖氨酸)的载玻片。外形可制成各种不同的形状。Lin，SR等人引采用APTS-BS3技术增强芯片与蛋白质的牢固结合。 22 探针的制备 低密度蛋白质芯片的探针包括特定的抗原、抗体、酶、吸水或疏水物质、结合某些阳离子或阴离子的化学集团、受体和免疫复合物等具有生物活性的蛋白质。制备时常常采用直接点样法，以避免蛋白质的空间结构改变56、。保持它和样品的特异性结合能力。高密度蛋白质芯片一般为基因表达产物，如一个cDNA文库所产生的几乎所有蛋白质均排：列在一个载体表面 ，其芯池数目高达1600个cm2，呈微距阵排列，点样时须用机械手进行，可同时检测数千个样品。 23 生物分子反应 使用时将待检的含有蛋白质的标本如尿液、血清、精液、组织提取物等，按一定程序做好层析、电泳、色谱等前处理，然后在每个芯池里点入需要的种类。一般样品量只要2-10L即可。 根据测定目的不同可选用不同探针结合或与其中含有的生物制剂相互作用一段时间，然后洗去未结合的或多余的物质，将样品固定一下等待检测即可。 24 信号的检测及分析 直接检测模式是将待测蛋白用荧57、光素或同位素标记，结合到芯片的蛋白质就会发出特定的信号，检测时用特殊的芯片扫描仪扫描和相应的计算机软件进行数据分析，或将芯片放射显影后再选用相应的软件进行数据分析。间接检测模式类似于ELISA方法，标记第二抗体分子。以上两种检测模式均基于阵列为基础的芯片检测技术。该法操作简单、成本低廉，可以在单一测量时间内完成多次重复性测量。目前，国外多采用质谱( mass spectrometryMS)分析基础上的新技术，如表面加强的激光离子解析一飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)，可使吸附在蛋白质芯片上的靶蛋白离子化，在电场力的作用下计算出其质量电荷比，与蛋白质数据库配合使用，来确定蛋白质片段的58、分子量和相对含量，可用来进行检测蛋白质谱的变化。光学蛋白芯片技术是基于1995年提出的光学椭圆生物传感器的概念。利用具有生物活性的的芯片上靶蛋白感应表面及生物分子的特异性结合性，可在椭偏光学成像观察下直接测定多种生物分子。 3. 蛋白芯片的分类目前蛋白芯片主要有三类：蛋白质微阵列、微孔板蛋白质芯片、三维凝胶块芯片等。 31 蛋白质微阵列 哈佛大学的Macbeath和SchreiberL等报：道了通过点样机械装置制作蛋白质芯片的研究，将针尖浸入装有纯化的蛋白质溶液的微孔中，然后移至载玻片上，在载玻片表面点上1nl的溶液，然后机械手重复操作，点不同的蛋白质。利用此装置大约固定了10，000种蛋白质59、，并用其研究蛋白质与蛋白质间，蛋白质与小分子间的特异性相互作用。Macbeath和Schreiber首先用一层小牛血清白蛋白(BSA)修饰玻片，可以防止固定在表面上的蛋白质变性。由于赖氨酸广泛存在于蛋白质的肽链中，BSA中的赖氨酸通过活性剂与点样的蛋白质样品所含的赖氨酸发生反应，使其结合在基片表面，并且一些蛋白质的活性区域露出。这样，利用点样装置将蛋白质固定在t3SA表面上，制作成蛋白质微阵列。 32 微孔板蛋白芯片 Mendoza等在传统微滴定板的基础上，利用机械手在96孔的每一个孔的平底上点样成同样的四组蛋白质，每组36个点(436阵列)，含有8种不同抗原和标记蛋白。可直接使用与之配套的全60、自动免疫分析仪，测定结果。适合蛋白质的大规模、多种类的筛选。 33 三维凝胶块芯片 三维凝胶块芯片是美国阿贡国家实验室和俄罗斯科学院恩格尔哈得分子生物学研究所开发的一种芯片技术。三维凝胶块芯片实质上是在基片上点布以10000个微小聚苯烯酰胺凝胶块，每个凝胶块可用于靶DNA、RNA和蛋白质的分析。这种芯片可用于筛选抗原抗体、酶动力学反应的研究。该系统的优点是：凝胶条的三维化能加进更多的已知样品，提高检测的灵敏度；蛋白质能够以天然状态分析，可以进行免疫测定、受体、配体研究和蛋白质组分分析。 4 蛋白质芯片的应用 41 用于基因表达的筛选AngelikaL等人从人胎儿脑的cDNA文库中选出92个克隆61、的粗提物制成蛋白质芯片，用特异性的抗体对其也进行检测，结果的准确率在87以上，而用传统的原位滤膜技术准确率只达到63。与原位滤膜相比，用蛋白质芯片技术在同样面积上可容纳更多的克隆，灵敏度可达到pg级。 42 用于特异性抗原抗体的检测在CavinM等人的实验中，蛋白质芯片上的抗原抗体反应体现出很好的特异性，在一块蛋白质芯片上10800个点中，根据抗原抗体的特异性结合检测到唯一的1个阳性位点。Cavin M指出，这种特异性的抗原抗体反应一旦确立，就可以利用这项技术来度量整个细胞或组织中的蛋白质的丰富程度和修饰程度。其次利用蛋白质芯片技术，根据与某一蛋白质的多种组分亲和的特征，筛选某一抗原的未知抗体62、，将常规的免疫分析微缩到芯片上进行，使免疫检测更加方便快捷。 43 用于蛋白质的筛选及功能研究 常规筛选蛋白质主要是在基因水平上进行，基因水平的筛选虽已被运用到任意的cDNA文库，但这种文库多以噬菌体为载体，：通过噬菌斑转印技术(plaque life procedure)在一张膜上表达蛋白质。但由于许多蛋白质不是全长基因编码，而且真核基因在细菌中往往不能产生正确折叠的蛋白质，况且噬菌斑转移不能缩小到毫米范围进行，所以这种方法的局限性，靠蛋白质芯片弥补。酶作为一种特殊的蛋白质，可以用蛋白质芯片来研究酶的底物、激活剂、抑制剂等。 蛋白质芯片为蛋白质功能研究提供了新的方法，合成的多肽及来源于细胞的63、蛋白质都可以用作制备蛋白质芯片的材料。Uetz将蛋白质芯片引入酵母双杂交研究中，大大提高了筛选率。建立了含6O0O个酵母蛋白的转化子，每个都具有开放性可阅读框架(Open Reading Frame，0FR)的融合蛋白作为酵母双杂交反应中的激活区，此蛋白质芯片检测到192个酵母蛋白与此发生阳性反应。 44 生化反应的检测 对酶活性的测定一直是临床生化检验中不可缺少的部分。Cohen用常规的光蚀刻技术制备芯片、酶及底物加到芯片上的小室，在电渗作用中使酸及底物经通道接触，发生酶促反应。通过电泳分离，可得到荧光标记的多肽底物及产物的变化，以此来定量酶促反应结果。动力学常数的测定表明该方法是可行的，而64、且，荧光物质稳定。Arenkov进行了类似的试验，他制备的蛋白质芯片片的一大优点，可以反复使用多次，大大降低了试验成本。 45 药物筛选 疾病的发生发展与某些蛋白质的变化有关，如果以这些蛋白质构筑芯片，对众多候选化学药物进行筛选，直接筛选出与靶蛋白作用的化学药物，将大大推进药物的开发。蛋白质芯片有助于了解药物与其效应蛋白的相互作用，并可以在对化学药物作用机制不甚了解的情况下直接研究蛋白质谱。还可以将化学药物作用与疾病联系起来，以及药物是否具有毒副作用、判定药物的治疗效果，为指导临床用药提供实验依据。另外，蛋白芯片技术还可对中药的真伪和有效成分进行快速鉴定和分析。 46 疾病诊断 蛋白质芯片技术65、在医学领域中有着潜在的广阔应用前景。蛋白质芯片能够同时检测生物样品中与某种疾病或者环境因素损伤可能相关的全部蛋白质的含量情况，即表型指纹(phenomic fingerprint )。表型指纹对监测疾病的过程或预测，判断治疗的效果也具有重要意义。Ciphelxen Biosystems公司利用蛋白质芯片检测了来自健康人和前列腺癌患者的血清样品，在短短的三天之内发现了6种潜在的前列腺癌的生物学标记。Englert将抗体点在片基上，月它检测正常组织和肿瘤之间蛋白质表达的差异，发现有些蛋白质的表达，如前列腺组织特异抗原，明胶酶 蛋白在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，这给肿瘤的诊断和治疗带来了新途径。66、应用蛋白质芯片在临床上还发现乳腺癌患者中的28.3KD的蛋白质；存在于结肠癌及其癌前病变患者的血清13.8KD的特异相关蛋白质。 5 存在问题 蛋白质芯片技术与基因芯片相比较，还处在起步阶段，无论在芯片的制备，具体应用过程以及结果的检测方面还有很多的不足。主要表现在： 51 灵敏度大部分病原微生物分子含量很低，必须经过信号放大才能检测到，目前常用的信号放大技术是PCR，PCR虽然能扩增目的基因，但如果单独采用，PCR技术又不能够体现生物芯片的高通量特点，所以新的信号放大技术是蛋白质芯片广泛应用急待解决的问题 。 52 准确度 虽然蛋白质芯片技术中能对肝炎病毒感染所引发的一系列免疫反应进行监测，67、但芯片实验的准确性在一定程度上受限于所选择的抗原或抗体的来源、纯度与特异性，并且蛋白类抗体的生产与应用存在着抗原性，免疫原性的强弱、异源抗体的类风湿因子和自身抗体的干扰、罕见抗体的高工作量筛选、克隆株(细胞)的不易保存、无法标准化生产、体内与体外的识别特异性差异、抗体一靶相瓦作用的动力学参数、对温度敏感所发生的不可逆变性等因素，限制了蛋白质芯片技术优势的充分发挥。 53 高密度 高密度芯片对病原体准确识别、比较基因组学分析、分型、突变分析及耐药检测是必须的。目前制备高密度芯片的方法主要是美国AFFYMERTRIX公司的光蚀到合成专利技术，限制了该技术的普遍采用。近来报导的喷印及分印章原位合成技68、术虽然避开了专利，但尚不成熟，因此，发展新的高密度合成技术势在必行。 54 普及 目前蛋白质芯片技术只限于在少数条件好的实验室进行对于大多数实验室来讲，设备昂贵，需要一定的时间。但随着经济的进一步改善，从根本上会满足需要。 蛋白质芯片技术在新世纪里不仅会对认识基因组与人类健康错综复杂的关系，对疾病的早期诊断和疗效监测等会产生巨大的推动作用，而且在其他相关领域如环境保护、食品卫生、生物工程、工业制药等方面也将具有广阔的发展前景。特别是随着人类基因组计划的完成，一个以研究蛋白质功能为重点的后基因组时代已拉开序幕，许多人预言，蛋白质芯片技术将从根本上改变生物学和生物技术的观点和效率，为生命科学的发展69、做出卓越贡献。本文来自: 医药社区() 详细出处参考：5、胶体金法5.1免疫胶体金技术的基本原理： 胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上70、结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术(Immunogold labelling technique) 主要利用了金颗71、粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。5.2功能：常用的免疫胶体金检测技术： （1）免疫胶体金光镜染色法 细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。 （2）免疫胶体金电镜染色法 可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和72、病毒检测。 斑点免疫金渗滤法 （3）应用微孔滤膜（如膜）作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。 （4）胶体金免疫层析法 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。第三节 胎膜早破体外诊断试剂盒竞争产品3.1国内主要竞争产品73、（胰岛素样生长因子结合蛋白-1）：主要竞争产品技术原理描述：（IGFBP-1）首先与金颗粒标记的鼠抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）的单克隆抗体结合，然后经过载体膜的层析泳动作用，与固定在载体膜检测线上的抗羊人胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）抗体结合；当宫颈分泌物中的IGFBP-1浓度400ug/l(相当于萃取至样本缓冲液中的浓度25ug/l)时，在检测线上可形成一条红色检测线条（T线），从而提示胎膜破裂可能已经发生。序号企业名称主营业务目前产品资质能力胎膜早破技术路线技术水平产品注册1成都某某生物科技有限公司临床诊断试剂的研发、生产和推广，目前专注于妇科检测领域74、胎膜早破快速检测试剂盒（胶体金法）即将面世，妊高症检测试剂盒正在研发针对可溶性细胞间粘附分子-1的胎膜早破检测方法在国内外属首创胶体金免疫层析法（检测对象：可溶性细胞间粘附分子-1）国内外首创；公司和四川大学合作开发，已申请多项专利，其中一项已获得实用新型专利证书，其他专利正在受理中预计4月内完成2安徽深蓝医疗科技有限公司计生用诊断试剂及生物原料研发、生产和销售有消毒型医用超声耦合剂、LH（排卵）检测试纸、HCG（早孕）检测试纸、妇科阴道病检查系列试剂盒、隐血系列检测试剂盒、胎膜早破检测试剂盒、白色念珠菌检测试剂盒、毒品检测试剂盒等系列产品在胶体金标记技术、单抗、多抗及免疫层析技术方面处于国内75、领先胶体金免疫层析法（检测对象：胰岛素样生长因子结合蛋白-1）已申请发明专利(申请号2011130619.2)已注册即将面世3武汉明德生物科技有限责任公司主要生产体外诊断试剂，降钙素原，HP抗原，心肌梗死检测等,心脏型脂肪酸结合蛋白快速检测试剂盒 N-末端脑钠肽快速检测试剂盒（PRO-BNP） D-二聚体快速检测试剂盒 肌钙蛋白I快速检测试剂盒(CTNI) 胎膜早破快速检测试剂盒(IGFBP-1)降钙素原快速检测试剂盒（PCT）等等以归国博士为骨干的研发生产团队；国家教育部和科技部举办的“第一届春晖杯中国留学人员创业创新大赛”获奖项目；目前已进入北京市、上海市、浙江省等多家医院销售，在心肌梗塞76、快速检测方面拥有发明专利，国内领先胶体金免疫层析法（检测对象：胰岛素样生长因子结合蛋白1）已注册已面世4重庆中元生物技术有限公司新型体外诊断试剂研制、生产和销售以及高值耗材经营胎膜早破快速检测试剂盒、同型半胱氨酸检测试剂盒（针对血栓、糖尿病）、胱抑素C检测试剂盒（针对婴幼儿肾病）等高新技术企业；重庆市医疗器械行业协会理事单位；国内率先生产用于检测孕妇胎膜早破的胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)和酶比色法的同型半胱氨酸(Hcy),生产的胶体金颗粒免疫比浊法的胱抑素C(Cys C)，在国内具有显著优势胶体金免疫层析法（胰岛素样生长因子结合蛋白-1）国内率先推出，创新基金项目，获得“高新77、技术产品”认证已注册已面世5江苏无锡生物医药园博慧斯生物医药科技公司结核病诊断试剂、胎膜早破诊断试剂，定性测定孕妇阴道分泌物中的胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1） 的含量。本产品采用免疫层析原理，采用鼠抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）的单克隆抗体作为检测抗体（用胶体金颗粒标记），抗羊人胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）的多克隆抗体作为捕获抗体,标本中的胰岛素样生长因子结合蛋白-12009年研发上市泰安康孕产诊断系列（IGFBP-1）首先与金颗粒标记的鼠抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）的单克隆抗体结合，然后经过载体膜的层析泳动作用，与固78、定在载体膜检测线上的抗羊人胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）抗体结合；当宫颈分泌物中的IGFBP-1浓度400ug/l(相当于萃取至样本缓冲液中的浓度25ug/l)时，在检测线上可形成一条红色检测线条（T线），从而提示胎膜破裂可能已经发生。已注册已面市3.2胰岛素样生长因子结合蛋白-1检测试剂盒案例：【产品名称】通用名称：胰岛素样生长因子结合蛋白-1检测试剂盒英文名称：Insulin like growth factor binding protein 1（IGFBP-1）test kit【包装规格】条型1人份/盒；2人份/盒；5人份/盒；10人份/盒；20人份/盒；50人份/盒；79、100人份/盒【预期用途】本品用于定性检测孕妇阴道分泌物中胰岛素样生长因子结合蛋白-1。【检验原理】本品采用免疫层析法原理，试纸条由在检测区（T）包被的抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1单克隆抗体1和质控区（C）包被的抗鼠多克隆抗体及在胶体金上包被的抗人胰岛素样生长因子结合蛋白-1单克隆抗体2组成，应用双抗体夹心法和免疫层析法的原理特异性地针对人羊水中的胰岛素样生长因子结合蛋白-1来为胎膜早破的诊断提供参考。【主要组成成份】1、 IGFBP-1检测试纸条；由PVC胶板、吸水纸、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、羊抗鼠多克隆抗体、IGFBP-1单克隆抗体1和IGFBP-1单克隆抗体2组成2、 缓冲液；含180、0mM，PH=7.4的磷酸盐缓冲液0.5ml3、 棉拭子。【储存条件及有效期】储存条件：于430避光干燥保存，不得冻存。有效期：18个月。【样本要求】样本为阴道分泌物或阴道流出液。已收集到样品收集管的分泌物样本应在1天内检测，但在1小时内检测，效果最佳。如样本被血液等污染将对检测结果造成干扰。【检验方法】在使用本产品前，请先查看盒中所有物品。在未做好测试准备前，请不要提前撕开铝箔袋。1. 将试剂盒内铝箔袋和缓冲液取出在室温下平衡。2. 打开铝箔袋，取出检测试纸条，标明被检样品和病人信息。从铝箔袋中取出试纸条后，应在1小时内尽快使用。3. 将缓冲液瓶甩两下，确保所有的液体都落于缓冲液瓶底部，打开81、缓冲液，竖放在桌面，将采集好标本的阴道棉拭子放入缓冲液瓶内，在缓冲液中旋转稀释充分浸洗。4. 将试纸条沿箭头方向垂直向下插入稀释标本后的缓冲液中。5. 待试纸条上能看到紫红色物质上移时拿出试纸条，将试纸条放置干净、干燥且平整的桌面上，15分钟内读取结果。注：下图为“育宜康”产品的【使用方法】【结果判断】1. 阳性：在检测区（T）及控制区（C）各出现一条色带，检测结果为阳性。2. 阴性：仅在控制区（C）出现一条色带，检测结果为阴性。3. 无效：控制区（C）无色带出现，表明试验无效，应重新进行检测。【检验方法的局限性】1. 本品是一种定性检测，无法得到定量结果。2. 结果的解释必须结合临床和治疗背82、景。3. 如发生较明显的出血时（拭子端明显变红），读取结果时应加以注意。4. 在极少数的案例中，当在胎膜破裂后超过12小时提取样本，由于阴道蛋白酶的影响造成IGFBP-1的降解而产生假阴性的结果。5. 阴道消毒洗液或阴道药物可导致假阴性的结果，应当在测试6个小时前停止使用。6. 拭子必须在收集样本后立即在缓冲液小瓶内被稀释。小瓶在4条件下最多可存放6小时，存放时间超过6小时，阴道分泌物中的蛋白酶将会使IGFBP-1发生变化。【产品性能指标】人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的最低检出量为20ng/ml。【注意事项】1使用前应详细阅读使用说明书，在有效期内使用；2.在标本采集和检测过程中，应做好无菌83、操作和个人安全防护；使用后的试剂立即销毁，用后应按医院或环保部门要求处置废弃物；3. 本品仅供体外诊断，一次性使用，包装破损不应使用，试纸条、阴道拭子和缓冲液瓶均不能重复使用；4.本品不同批号间的各组分不得混用。5不得使用过期、被损坏或污染的试剂；产品的使用环境应满足检测条件要求。由于是定性的方法也就是说只是给出阳性阴性的结果，而不能给出准确的数值。【生产许可证号】皖食药监械生产许20100222号【生产企业】安徽深蓝医疗科技有限公司 注册地址：安徽省合肥市蜀山区蜀山新产业园振兴路6#3层生产地址：安徽省合肥市蜀山区蜀山新产业园振兴路6#3层3.3国外竞争性产品：进口代理商生产商国别产品名称技84、术路线产品注册产品面市上海基恩科技有限公司Oy Medix Biochemica Ab芬兰胰岛素样生长因子结合蛋白检测试剂盒免疫层析法（检测对象：胰岛素样生长因子结合蛋白）已注册（国食药监械(进)字2008第2402582号）已面市上海基恩科技有限公司Oy Medix Biochemica Ab芬兰磷酸化胰岛素样生长因子结合蛋白检测试剂盒免疫层析法（检测对象：磷酸化胰岛素样生长因子结合蛋白）已注册（国食药监械(进)字2008第2402583号）已面市深圳微点生物技术有限公司BIOSYNEX法国胰岛素样生长因子结合蛋白检测试剂盒(商品名:爱母捷)免疫层析法（检测对象：胰岛素样生长因子结合蛋白）已85、注册（国食药监械(进)字2010第2403372号）已面市3.3（1）技术性指标：一、国外报道对比数据： IGFBP-1 & sICAM-1（*Proteomics Clin. Appl. 2011, 5, 415421）sICAM-1可溶性细胞间粘附分子明显优于IGFBP-1胰岛素样生长因子结合蛋白，是目前最优异的胎膜早破诊断标记物 二、与法国爱母捷50例临床试验技术数据指标对比：育宜康爱母捷灵敏度94%（47/50）80%（40/50）特异性96%（48/50）100%（50/50）阳性预测值94%47/(47+2）100%40/40阴性预测值94.12%48/(48+3）83.3%50/86、（50+10）准确性95%（47+48)/10090%（40+50）/100假阳性率4%（2/50）0假阴性率6%（3/50）20%（10/50）从上述数据可以看出，在假阴性一项中，“育宜康”所检测的“可溶性细胞间粘附分子-1”灵敏度明显优于“胰岛素样生长因子结合蛋白”，这对于胎膜微型破口的漏诊率降低有非常显著的意义。3.3（2）使用便捷性：1. 爱母捷取样时间稍长，达1分钟，容易造成患者的不适感；育宜康只需伸入阴道后穹窿处，旋转5圈取样，时间不会超过30秒。 2. 爱母捷读取结果时间较长，10-15min；育宜康读取结果的时间为3-6min。 3. 爱母捷读取结果的过程略显复杂，需检测者手持87、试纸条将其浸入缓冲液中10min，且需保持垂直状态，容易造成检测者疲劳；育宜康只需将试纸条平放，向加样孔中加入3滴样本液后即可开始结果的读取，操作简单。 4. 爱母捷由于无卡壳，读取结果过程中的条件要求繁杂（洁净、干燥且平整），且无卡壳试纸条可能易受到污染，由于无卡壳，而试纸条又略窄，对使用者的拿取带来了一定的不便；育宜康只需将试纸条平放即可，无其他特殊要求，且方便使用者拿取进行检测。第三章 “育宜康”诊断试剂项目所应用技术工艺及主体设备调查第一节：生产工艺调查1.1产品生产本公司集研发、生产和推广为一体，产品具有自主知识产权，属于自建厂房生产。公司购买天府生命科技园b7研发楼202、301、88、302室共计2200m2其中生产面积400m2，办公面积710m2，另有1000m2备用，目前生产厂房已不能满足生产需求，正计划技改扩大厂房。1.2生产设备情况公司现有生产设备共计80台/套,共计约150万元，其中进口设备有biodot喷涂平台两台、miliipore纯水机一台、精密移液器、电子天平等，另有超低温冰箱、分光光度计等先进仪器设备多台。1.3 产品工艺流程育宜康为体外诊断试剂（胶体金法）其主要的生产过程包括制金标记包被干燥内包装外包装等多道工序，在每道主要工序完成后就进行质量检验以保证产品质量。产品工艺稳定可靠，简易流程图如下：第二节：生产设备连续划膜机2011.1 75,000.89、00 喷金标机 67,000.00 可编程切条机 25,000.00 压壳机 8,000.00 台手动裁纸刀 5,000.00 高速冷冻离心机 32,520.00 微量台式高速离心机 2,560.00 磁力搅拌器 2,000.00 电子天平2011.2 8,900.00 紫外可见分光光度计 8,600.00 不锈钢立式灭菌器 6,590.00 激光尘埃粒子计数器 7,900.00 超净工作台 5,200.00 电子天平2011.4 8,900.00 鼓风干燥箱DHG-9245A两台2011.6 8,000.00 H2050R离心机角转子 3,840.00 漩涡混合器MS3两台 5,540.0090、 紫外分光光度计UV-5100 38,000.00 霉菌培养箱MJ-70-1 4,500.00 角转子8*15ml 4,500.00 钢印打标机 4,020.00 全钢通风柜 7,817.05 风量控制系统 1,870.16 PP离心风机及PVC风管 989.50 中央实验台（质检室） 6,037.93 中央实验台（研究室） 10,734.36 振华实验设备一批2011.7 202,140.00 净化系统 121,687.00 磁力搅拌器 3,000.00 购优普超纯水机2011.8 31,000.00 超低温冰箱2011.11 37,000.00 折纸机2012.2 8,000.00 三维喷91、点平台2台 574,700.88 干燥箱隔板2012.3 1,600.00 固利美贴标机及下料机2012.5 93,162.39 喷码机（上海迪凯） 10,940.17 第三节：产品质量 3.1上游产品质量原材料、元器件、配件以及关键零部件等生产必须品的进货渠道稳定、可靠。根据YY/T0287 idt ISO-13485和医疗器械生产实施细则的相关要求，我们建立了完整的供应商评价体系，对主要供应商行业资质、生产规模、供货能力等方面进行全面审查，建立合格供应商名单及档案。建立了对合格供应商跟踪复评制度确保供应商有能力满足本公司需求。对某些特殊材料除主要供应商外还选取12家供应商作为备用供应商以满92、足生产需求。3.2 产品的质量保证体系。在生产过程中我们严格执行公司建立的质量体系。在生产前，生产环境、各原辅料、设施设备等必须经过检验确保其合格有效方可进行生产。生产过程中严格按照生产工艺要求和标准操作规程作业；在标记、干燥等工序设立质量控制点，经检验合格后放行；按规定填写生产和检验记录；按规定填写各种标识和标牌和严格的清场防止混淆和交叉污染。在当前的小批量生产过程中产品的最终收率为85%90%第四章 胎膜早破诊断试剂项目产成品市场调查第一节 妇产科诊断试剂的市场策略1.1市场规模：全中国每年有2000万孕妇，仅估计胎膜早破的平均发病率14%计算，有280万孕妇会发生胎膜早破，而临床诊断需求93、量约为确诊病例的3倍以上，在欧美等发达国家保守统计，至少也有30%使用率。所以年诊断需求量至少600万人份，如胎膜早破成为常规普查项目，市场最大潜力容量可扩充到50%，即1000万人份。妊高征是孕妇常规预期检查项目，目前，中国孕妇建档率约为45%，每年约有900万孕妇在医院孕期检查，如果如平均使用2次，年诊断需求量可达1800万人次。 即使按普查时价格估计，40-60元每次，市场规模仍有20-30亿。 在培育市场初期，可能出现100至240元的价位，市场规模小则16亿，中则50亿，大则180亿。1.2重点市场推广策略全国三级医院及专科二级以上医院建档孕妇约占300万，三级以下医院孕妇约600万94、。这些医院仍存在的实际情况是：1、现有技术不能满足临床缺失的诊断需求；2、部分医务人员以及孕妇对疾病和诊断方法认知极低；3、对现有诊断技术，短期内（1.5年）没有竞争者或称得上竞争者的产品出现。 重点医院向二线医院乃至用户市场覆盖：主要以“育宜康”进入临床领域，树立品牌形象，培育孕妇消费习惯并树立孕检理念。后续产品“安宜康” 推广至医院外的自主市场，会更快更大。而引领市场的还是一线重点医生，所以，从第一个产品开始，就需要建立、巩固市级重点医院关系，树立试点医院标杆作用。对重点市场，要从“临床”向患者推荐使用产品，类似于处方药销售。 1.3实施情况在全国31个省市自治区，除西藏、海南、内蒙暂不关95、注外，确定四川、辽宁、北京、河南、湖北、山东、江苏、上海、福建、广东、黑龙江、吉林、安徽、湖南、河北、天津16个区域建立直销队伍。上半年已经完成前10个目标城市布点，目前已在四川、辽宁、河南、湖北、山东、江苏、上海、福建共8个地区确定了地区管理者，开展市场调查、专家攻关等销售前工作；并确定浙江、重庆、陕西、甘肃、宁夏、云南、贵州、广西、江西、山西、新疆、青海共12个区域建立分销队伍，前期投入由分销商承担，队伍是专职或以专职为目标发展的临床队伍，统一由某某生物培训，队伍的临床模式与直销队伍无明显差异，前8个为上半年目标，目前已经完成前5个区域的分销商意向协议，并已开展地区销售前工作，包括市场调查96、专家关系、政府关系。云南、贵州、广西已经开展分销商沟通，推广思路、专职队伍、长期合作等3方面还未达成一致，尚未最后确定分销商。第二节 推广策略1、产品直销与分销结合； （1）成都市标杆医院某某产品“金标准”推荐会； （2）得到区发改委支持，进入全省新增医疗项目目录，发改委定价，进入医院检测项目采购计划目录； （3）与临床医生达成共识，专家、医院推荐使用。 （4）已经免费在试点医院使用； （5）区域性分销点的建立，取得西南地区知名度，并向全国辐射。 2、坚持学术推广，开展孕期教育普及； 3、与专业协会、妇联、计生委直接合作； 4、改变我国孕产妇女健康普查环境，奠定优生优育领域品牌地位。 具体销97、售计划 3.1第一步：重点医院、样板示范医院打造；目标：28个省会级城市的省、市妇幼保健院和医学院附属专科医院。 全国13家年新生儿过万的医院中只有2家是医学院附属妇产医院，其余都是妇幼保健专科医院；年新生儿超过5000的医院中，75%都是妇幼保健专科医院，所以最大的市场来自于这样的专科医院。同时，这些专科医院都在向规模化发展，孕产妇集中度、特别是经济条件好的孕产妇集中度非常高，第一步重点医院、样板医院几乎涵盖了所有年新生儿过5000的医院。方法：课题合作、样品使用；开展孕妇课堂；专业学术会议赞助测算：全国69家样板医院中有58家年新生儿过5000，这58家医院平均年新生儿7500，约高于成都98、妇女儿童中心的50%，按50%计，头12个月58家样板医院产生35万盒销售，头6个月仅开发41家样板医院，能计入头12个月销售的约为21万盒。其他138家医院的销售约为样板医院的1/3。忽略第6-12月开发医院的较低产出，头12个月产出在28万盒以上。按照70%成功率计算，头12个月保守销售量为20万盒。实际回款收入2500万-3500万（发改委定价决定回款价，零售价区间在200-280，实际执行零售价在200-250，回款价约为零售价的0.7，部分区域分销，实际回款价总额低于按0.7计算的结果）。实施：28个省会是除外海南、西藏、内蒙之外的28个省、自治区、直辖市前半年13个城市是北京、上海99、重庆、沈阳、济南、郑州、武汉、成都、西安、南京、杭州、福州、广州，共41家医院；后半年15个城市是哈尔滨、吉林、天津、石家庄、乌鲁木齐、兰州、宁夏、西宁、长沙、昆明、贵州、南昌、合肥、南宁、太原，共28家医院。在样板医院以外的目标医院，包括部分省会城市的区级妇幼保健院、非省会城市的重点城市的市级妇幼保健院、有妇产专科的三甲综合医院，第一步目标医院还有138家。第一步目标医院共计207家。目标孕妇60-70万。按30%孕妇使用1次计算，至少是3000万销售。3.2第二步：由点及面，覆盖目标区域的二线城市；目标：省级区二线城市80%覆盖推广。 二线城市指类似四川的攀枝花、泸州、南充等等城市，一般100、一个城市1-2家医院，第二步在第一步207家医院的基础上，300个左右地级市还要增加400家医院左右。第一步是推广“准确”相关的“确诊”信息，奠定“有效、好用”的基础，使医生充分掌握使用；第二步推广“方便、快捷”等“便捷”相关信息，让医生推荐孕妇在家里常备，遇到阴道流液量增加，先排查是否胎膜早破，让孕妇及时知晓可能的风险大小及是否需要及时到医院就诊。方法：区域专业学术会议推广孕妇系统知识普及，提高主动性开展妇联、计生委项目，辅助提高公众认知3.3第三步：由临床到院外使用，由“诊断需要”向“孕检筛查”转化；成为孕期普查项目。目标： 专业协会推荐；妇联、计生委推荐；渠道建设。“确诊”向“筛查”的转101、化，是1次使用向多次使用、有必要使用向有需要使用的转化，市场在此期间扩大3-5倍，销售额在1亿左右。如能解决孕妇取样问题，孕妇知识具备一定操作水平，产品的“自用”便捷性可以显现，另外某某公司目前在研的重点技术课题。同时， “安宜康”产品通过尿液检测，完全具备市场推广价值。案例1：成都市妇女儿童中心医院成都市妇女儿童中心医院销售预计： 1、试用阶段，疑似病例使用1次，月均1200孕妇，30%疑似，月均使用360盒 2、接受阶段，疑似病例+高危病例使用，人均2次，40%孕妇使用，月均960盒 3、认可阶段，疑似+高危+关注安全孕妇，45%孕妇使用，人均2.5次，月均1350盒 全年合计12060盒102、案例2：前期就西北市场情况做了调查，大致情况如下：西北五省总人口数.育龄人口数序号省份总人口数(万)育龄人口数(万)人口自然增长率1宁夏回族自治区6301309.042陕西省375265643青海省557.31608.324甘肃省267523075新疆维吾尔自治区215855011.78合计9772.31726宁夏回族自治区三甲医院及妇幼保健院目录序号名称床位数(张)日门诊量(人)1宁夏区人民医院120016502宁夏医学院附属医院120020893宁夏医学院第二附属医院80015004银川市妇幼保健院2085005宁夏区妇幼保健院100876吴忠市人民医院4106247银川市中医院18943103、18石嘴山市第一人民医院3205209石嘴山市第二人民医院28030010宁夏煤炭职工总院21034011中宁县医院20017612中卫县医院370521合计：54878738陕西省三甲医院及妇幼保健院目录序号名称床位数(张)日门诊量(人)1西安交通大学医学院第一附属医院200045002陕西省人民医院7699603西安市第一医院50012004西安交通大学医学院第二附属医院100013705陕西省中医医院5005756陕西省妇幼保健院2005007西安市中心医院58214618西安市第一医院6008149西安市第四医院551102510解放军第四军医大学西京医院1700500011解放军第四104、军医大学唐都医院1100136212西安红十字会医院500400013西安万杰华翔医院10001600合计：1100224367青海省三甲医院及妇幼保健院目录序号名称床位数(张)日门诊量(人)1青海省妇女儿童医院3904672青海大学附属医院104615003青海省交通医院38012004青海省中医院4005615西宁市第二人民医院3302706西宁市第一人民医院5106807西宁市妇幼保健院651148解放军第四陆军医院1504509青海省人民医院10201200合计42916442甘肃省三甲医院及妇幼保健院目录序号名称床位数(张)日门诊量(人)1甘肃省妇幼保健院3003742甘肃省人民医院105、65010963兰州市第一人民医院6805004兰州市妇幼保健院2501735兰州医学院第一附属医院81610006兰州医学院第二附属医院7808657解放军第四七三医院空军兰州医院5007008解放军第一医院三爱堂医院524500合计：45005208 新疆维吾尔自治区三甲医院及妇幼保健院目录序号名称床位数(张)日门诊量(人)1兰州军区乌鲁木齐总院80012602新疆自治区人民医院130016503新疆医科大学第一附属医院120021004乌鲁木齐市友谊医院70217005新疆医科大学第五附属医院80012306空军乌鲁木齐医院5006807新疆医科大学第二附属医院104015008乌鲁木齐106、市妇产医院203800合计：654510920第四节 主要产品分类价格水平调查1.项目产品生产成本分析A、项目产品生产成本的主要构成因素分析产品生产的成本主要由原料成本、厂房设备折旧、水电气成本、人力成本、运输成本、管理成本等。其中原料成本约占中成本的3/5，设备折旧及水电成本等运行成本约占中成本的1/5,人员及管理成本约占1/5。B、预测产品的单位成本预计产品单位成本为75元。2.项目产品定价A、定价策略本产品采用边际成本定价法。其中固定成本70元，变动成本10元，按照60%的利润确定价格为200。B、分析说明项目产品的价格产品预期定价为200元,其中固定成本70元，变动成本10元。第五节 107、2013-2017年新型诊断试剂产品产销统计及预测项目产品销售预测达产的年份生产规模预计销售额第一年(2013年)25万30万条5000 6000万第二年(2014年)40万50万条8000万 1.2亿第三年(2015年)75万80万条1.2亿 1.8亿该项目建设期2年，第3年达到设计生产能力，2013年形成销售收入5000万元，税后利润1250万元；投资利润率为83.33，静态投资回收期为3.2年。第五章 新型诊断试剂项目风险防控策略建议5.1财务分析一、公司基本情况表1：历次股权变动情况表（单位：万元）序号日期注册资本实缴资本股东股东1500500关祥乾（85%）胡怀忠（15%）21000108、1000关祥乾（92.5%）胡怀忠（7.5%）310001000关祥乾（62%）胡怀忠（38%）表2：目前股权结构表 股东股东名称投资额(万元）占公司股份比例甲方关详乾62062%乙方胡怀中38038%二、公司经营情况截至五月底，公司尚无形成营业收入表3：管理费用明细表 单位：万元项目2012年5月底金额比例 职工工资 28.17 19.79% 福利费 4.95 3.47% 办公费 17.55 12.33% 差旅费 4.23 2.97% 研发费 0.45 0.32% 汽车费 7.73 5.43% 业务招待费 8.60 6.04% 房租/物管 5.40 3.79% 装修费 23.09 16.22109、% 水电费 5.12 3.59% 折旧费 16.84 11.83% 交通费 0.05 0.04% 通讯费 1.56 1.09% 会务费 3.75 2.64% 职工教育经费 1.11 0.78% 咨询费 6.03 4.24% 税金 1.71 1.20% 住房公积金 0.84 0.59% 社会保险 2.75 1.93% 广告宣传费 1.80 1.26% 工会经费 0.64 0.45%合计 142.38 100.00%表4：营业费用明细表 单位：万元项目2012年5月底金额比例 广告费 11.47 34.02% 福利费 0.47 1.39% 办公费 1.64 4.85% 差旅费 3.90 11.57110、% 职工工资 7.19 21.31% 汽车费 0.43 1.27% 业务招待费 1.73 5.12% 会务费 3.57 10.57% 交通费 0.24 0.71% 通讯费 0.62 1.84% 社保 0.86 2.56% 公积金 0.22 0.64% 劳保费 1.40 4.15%合计 33.72 100.00%表5：财务费用明细表 单位：万元项目2012年5月底金额比例利息收入-0.08-0.26%利息支出18.9260.35%手续费0.983.13%担保费11.5336.78%合计31.34100.00%三、资产质量分析（一）资产结构表6：资产结构表 单位：万元项目2012年5月比例货币资金111、858.1328.04%预付账款116.763.82%其他应收款3.480.11%存货115.343.77%流动资产合计1,093.7235.74%固定资产1,390.7645.44%无形资产200.056.54%开发支出52.421.71%长期待摊费用323.4010.57%非流动资产合计1,966.6364.26%资产总计3,060.34100.00%货币资金858.13万元，其中现金9.21万元，银行存款848.93万元。长期待摊费用主要为房屋装修费。表7：预付账款明细表 单位：万元序号客户名称金额比例账龄1成都原点装饰工程有限公司 31.00 26.55%1年内3四川省华盛消防工程有限112、责任公司 2.00 1.71%1年内4成都东方税进科技有限公司 0.30 0.26%1年内5沧州盛美包装材料有限公司 7.30 6.25%1年内9上海捷宁生物科技有限公司 0.33 0.28%1年内10变色龙品牌设计工作室 2.00 1.71%1年内11成都人南狮子楼餐饮有限责任公司 2.39 2.04%1年内12京天成生物技术（北京）有限公司 7.40 6.34%1年内13上海杰一生物技术有限公司 0.07 0.06%1年内14成都豪润饮食文化发展有限公司 2.00 1.71%1年内15上海明利包装印刷公司 0.18 0.15%1年内16惠州市惠阳区秋长中泰净化用品经营部 0.30 0.26113、%1年内17四川省卫欣投资有限公司 50.00 42.82%1年内18成都黑森林广告有限公司 5.00 4.28%1年内19成都银都物业服务有限公司 0.49 0.42%1年内20四川省工程咨询研究院 6.00 5.14%1年内合计 116.76 100.00%1年内表8：其他应收款项明细表 单位：万元序号客户名称金额比例账龄1 单位应收 1.28 36.85%1年内2 张聪征 0.50 14.35%1年内3 胡建 1.00 28.70%1年内4 行政部 0.20 5.74%1年内5 侯国伟 0.50 14.35%1年内合计 3.48 100.00%（三）存货结构分析表9：存货构成情况表 单位114、：万元项目金额比例跌价准备原材料 104.38 90.50%-周转材料-低值易耗品 10.95 9.50%-合计 115.34 100%-（四）固定资产结构分析表10：固定资产明细表项目2012年5月备注房屋-B7-301408.29抵押房屋-B7-302400.34抵押房屋-B7-202397.21否小计1205.84家具设备57.13电子设备21.99奔驰商务车28.00机械设备145.02总计1457.99表11：无形资产明细表项目2012年5月备注胎膜早破199.01商标权1.04总计200.05四、负债结构分析表12：负债结构表 单位：万元项目金额比例短期借款 850.00 33.2115、9%应付票据 500.00 19.58%应付账款 6.67 0.26%应付职工薪酬 -2.36 -0.09%应交税费 -13.59 -0.53%其他应付款 962.46 37.70%流动负债合计 2,303.18 90.21%长期借款 40.00 1.57%专项应付款 210.00 8.23%非流动负债合计 250.00 9.79%负债合计 2,553.18 100.00%长期借款40万表13：短期借款明细 单位：万元名称金额比例内容哈尔滨银行 350.00 41.18%一年期贷款哈尔滨银行 500.00 58.82%一年期贷款表14：应付账款明细表 单位：万元名称金额比例内容四川合恒安装工程116、有限公司 3.60 53.97%成都思博特实验设备有限公司 0.20 3.00%成都云鸿科技发展有限公司 0.20 3.00%四川万兴智能控制系统工程有限公司 1.58 23.69%成都周之科技有限公司 0.10 1.50%上海固利美包装机械有限公司 0.99 14.84%合计 6.67 100.00%表15：其他应付款结构表 单位：万元名称金额比例备注成都成高阀门销售有限公司30.003.12%2011.7.1-2011.12.31（无息）成都成高阀门销售有限公司100.0010.39%2011.8.1-2012.6.29（无息）成都成高阀门销售有限公司100.0010.39%2012.2.117、2-2012.4.30（无息）关祥乾733.6076.22%个人社保-0.64-0.07%个人住房公积金-0.5-0.05%合计962.46100.00%表16：专项应付款明细 单位：万元项目2012年5月备注市科技局科技支撑计划项目20.00高新区重点科技创新计划项目50.00成都市高层次人才专项资金100.00市科技局科技型中小企业 30.00高新区地方创新基金10.00总计210.00六、税收优惠政策七、利润情况表19：20102011年公司利润 单位：万元项目201020112012.5一、营业收入合计主营业务收入其他业务收入二、营业成本合计主营业务成本其他业务成本三、营业税金及附加四118、期间费用合计管理费用 21.11 226.16 142.38 销售费用 - - 33.72 财务费用 -0.21 7.52 31.34 五、营业利润 -20.90 -233.68 -207.45 加：投资收益 - - - 营业外收入 - 4.07 1.55 减：营业外支出 - 0.76 - 六、利润总额 -20.90 -230.37 -205.90 所得税 - - - 七、净利润 -20.90 -230.37 -205.90毛利率净利率5.2投资保障及相关安排1、合同： 增资协议书本次拟投资200万元，占股4.76%，某某公司注册资本增加至1050万元。 2、限制性条款：第一条 公司估值1.119、1本轮乙方对甲方公司估值按照以下方法计算：公司价值=NPV(irr,N1,N2,N3,N4,N5)，NPV为公司未来五年公司净现值；irr=40%为本轮投资人内部收益率或折现率；N1N2N3N4N5为公司增资之日起连续五个会计年度净利润或预测净利润。1.2：经三方讨论确认2012年-2017年的净利润如下表：2013年2014年2015年2016年2017年3366721008134416801.3:如果公司预测净利润未能完成，将按照实际完成数调整公司估值，从而调整本轮投资人持股比例；1.4:公司估值最低不低于本轮增资价格。第二条 重大事项2.1本轮投资人对甲方的增资，自工商登记手续完成之日正120、式完成。2.2公司重大事项须经本轮投资人同意才能够通过：修改公司的章程或其它章程性文件。 公司解散、清算、合并、分立、出售公司重大资产； 对外股权投资及债券投资；设立期权计划；公司与其他任何机构签订股票回购的协议；决定任何公司或子公司与其关联机构或董事、股东、高级管理人员进行的交易价格（包括但不限于以成本加成法为基础的机制中的提价幅度）的机制，或公司或其子公司向其关联机构支付超过人民币100,000元以上的现金，或在任意12个月内支付总计金额超过人民币1,000,000元的现金。公司进入非主营业务经营领域；公司的利润分配方案；对外担保；除本协议约定之外的董事会、监事会成员的增减及更换；公司经营121、方针的制定；审议批准公司年度财务预算决算方案。将公司资金借予任何法人和自然人；2.3任何公司专利或专有技术的对外合作，公司无形资产的转让和许可。截止本协议签订之时，公司已申请或已获得的知识产权包括但不限于：已获得专利：专利名称性质专利号证书号专利申请日授权公布日以ICAM-1为检测指标的胎膜早破快速检测工具与检测盒实用新型专利ZL 2010 2 0212382.116487022010-06-022011-01-05以Asipsin为检查指标的子痫前期快速检测工具与检测盒实用新型专利201120456278.1/2011-11-172012-04-25目前正在申请专利：专利名称性质申请号以Ax122、l为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及制备方法发明专利201010189639.0以ICAM-1为检测指标的胎膜早破快速检测工具与检测盒发明专利201010189683.1 以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及制备方法发明专利201010189663.4以Asipsin为检查指标的子痫前期检测试剂盒及制作方法发明专利201110365299.7以Asipsin为检查指标的子痫前期快速检测工具与检测盒及制作方法发明专利201110365180.X以ICAM-1为检测指标的胎膜早破快速检测工具与检测盒发明专利PCT/CN2011/074383以Asipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒及制123、备方法发明专利PCT/CN2012/070010以Asipsin为检测指标的子痫前期快速检测工具与检测盒及制作方法发明专利PCT/CN2012/070011 第三条 股权转让的限制3.1本轮增资完成后至公司上市前，未经本轮投资人事先同意，控股股东不得向任何第三方转让其直接或间接持有的公司股权。经本轮投资人同意，转让时，本轮投资人有权按本协议的约定行使优先购买权或/和共同出售权。第四条 竞业禁止约定4.1公司和丙方应确保关联机构不得以任何方式直接或间接参与任何与公司从事的业务存在同业竞争的业务或活动。第五条 优先购买权和共同出售权 5.1如控股股东收到任何第三方发出的以现金、流通证券或其它对价购124、买已发行有表决权股份，并满足全部下列条件的要约， 控股股东应尽快但在任何情况下不迟于其收到第三方要约后七（7）个工作日向本轮投资人发出通知，载明本轮投资人可按第三方要约的相同价格及条件和条款向第三方买方出售随售股份：5.2“第三方要约通知”应载明相关详细信息；5.3本轮投资人收到第三方要约通知，可选择：在随售期内向现有股东发出经本轮投资人董事会批准的一份书面通知要求现有股东安排本轮投资人将本轮投资人持有的一定数量的股份以第三方要约的条款和条件，随同现有股东的要约股份一起出售给第三方买方；随售通知应列明本轮投资人随售股份的数额，该数额应为：C，其中：A=本轮投资人（一方或多方）股份持股量；B=全125、体拟出售方持有公司已发行股份的总数；及C=第三方要约所列的要约股份；按照同样的价格和条件，单独售予该第三方买方或其他拟购买的公司本轮投资方持有的股权；如控股股东不同意本轮投资方单独出售，则控股股东应以同等价格进行回购；在随售期内，向现有股东发出书面通知拒绝接受第三方要约通知中的要约或不回复第三方要约通知；在此情况下，现有股东有权按第三方要约通知的条款和条件向第三方买方出售全部（而非部分的）要约股份。第六条 反稀释权6.1本轮增资完成后，公司不得以低于本轮增资的对价进行新的权益性融资。如果公司以低于交易的对价进行新的权益性融资，则本轮投资人有权要求控股股东无偿转让其持有的部分公司股权给本轮投资人126、或向本轮投资人支付现金补偿，以使本轮投资人的增资对价加上10%的年内部收益率（从本轮投资人支付全部转让价款之日起计算至补偿实际支付之日）降低至该较低的权益性融资的价格。第七条 优先认购权7.1对于公司新增的注册资本或新发行的权益性证券，本轮投资人有权按持有公司股权的比例予以优先认购以维持其在公司的股权比例不变。第八条 清算优先权8.1在下列情况下本轮投资人具有公司清偿权：A：控股股东违背本协议第四条、第五条和第六条约定内容而不履行回购义务时；B：自本轮投资人增资之日起，公司连续三年净利润低于预测值的70%，或公司某年净利润低于预测值的50%。8.2如果公司在上市前解散并进行清算，对于清算后属于127、股东的财产，控股股东应当对本轮投资人进行补偿，以使本轮投资人获得不低于交易的投资总额加10%的年内部收益率（从本轮投资人支付全部转让价款之日起计算至清算实际分配之日）的分配。第九条 知情权公司须向本轮投资人定期提供：9.1每个会计年度结束后4个月内提供公司经审计的合并损益表、资产负债表和现金流量表； 9.2每季度结束后30日内提供合并的季度损益表、资产负债表和现金流量表； 9.3不迟于每个会计年度开始前30日内提供年度预算和财务预测； 9.4及时提供公司上市相关的任何进展的细节； 9.5在本轮投资人提前通知后的合理时间内，准许其接触公司的帐簿和记录、设施、房产、管理层、员工，以及会计和法律顾问128、；9.6在银行撤销公司任何授信额度时，立即通知本轮投资人；9.7在公司发生任何重大诉讼或可能导致重大诉讼的情形时，立即通知本轮投资人； 11.8提前通知本轮投资人任何下属子公司股权结构的任何变化。第十条 回赎权10.1如下述情形发生之日起，本轮投资人有权以年内部收益率10%（从本轮投资人支付全部股权转让价款之日起计算至回购金额实际支付之日）的回购价格，要求控股股东或实际控制人在3个月内回购本轮投资人届时持有的公司全部股权：（1）公司没有在2017年12月31日前完成上市时；（2）公司的主要专利技术或专有技术权属有法律瑕疵时（主要专利或专有技术指包括不限于以下：列明专利或专有技术）； （3）公司专利或专有技术未经本轮投资人同意对外合作时；（4）控股股东违背本协议第一条、第二条和第三条约定内容时。对上述限制性条款某某公司控股股东关祥乾承担连带责任，保障投资人利益； 附件： 1、财务调查报告64