1、临床血清、血浆标本丙型肝炎病毒核酸定量检测作业指导书编 制： 审 核： 批 准： 版 本 号: ESZAQDGF001 编 制： 审 核: 批 准： 发 布： 二XX年X月1. 目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的丙型肝炎病毒核酸的定性检测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断。2. 范围适用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。3. 职责3.1 操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。3.2 专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。3.3 实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。4. 原理采用荧光PCR技术，以丙型2、肝炎病毒基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行一步法RT-PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT)实现对未知样本的检测。另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。5. 样本要求5.1 适用标本类型：血清5.2 标本采集用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2 ml，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。5.3 标本保存和运送所采集的3、标本可立即用于测试或长期保存于-70，也可保存于-20待测，保存期为3个月，标本应避免反复冻融。标本运送采用干冰（或者冰袋）保持低温，运输时间不应超过4天。5.4 拒收标本：拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆。6. 仪器和试剂6.1 设备AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。6.2 试剂生产厂家：xx大学xx基因股份有限公司产品标准批号：YZB/国 7271-2013最低检出量：最低检出量为500 IU/ml试剂各组分见表1：表1 试剂盒组分表组 分 名 称规 格数 量核酸提取试剂RNA提取液A200 ul/管1RNA提取液B5 ml/瓶2DEPC H2O3 ml/瓶1P4、CR 检测试剂HCV内标溶液100 ul/管1HCV反应液A270 ul/管1HCV反应液B30 ul/管1质控品阴性质控品200 ul/管1HCV强阳性质控品200 ul/管1HCV临界阳性质控品200 ul/管17. 操作步骤7.1试剂准备（试剂储存和准备区）7.1.1 进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面，并在检验流程记录表上做相应记录。 PCR反应液配制7.1.2.1 取出HCV反应液A、HCV反应液AB，室温溶化后振荡混匀，8000rpm离心数秒后使用。取出N个（N = 待测样本数+ 4个HCV阳性定量标准品+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品5、+空白孔）PCR反应管，HCV单人份扩增体系配制见表2：表2 PCR反应液配置表组分HCV反应液AHCV反应液B总体积用量/人份27 ul3 ul30 ul将各组分充分混匀，混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将30 ul扩增体系分装到PCR反应管，反应液分装时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区。7.1.3 75%乙醇配制：取2.25 ml的DEPC H2O，加入6.75ml的无水乙醇，振荡混匀，配制成75%乙醇，盖紧盖子，经传递窗传递到标本制备区。7.2 RNA提取（标本制备区）7.2.1 进入标本制备区，从传递窗中取出PCR反应管和75%乙醇，放入标本制6、备区冰箱冷藏。7.2.2 从冰箱取出待测样本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、RNA提取液A、RNA提取液B和内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。 打开金属浴，调节温度为65，使仪器自动升温。用镊子夹取n个1.5 ml灭菌离心管放于安全柜内离心管架上。（n= 待测样本数+ 3 = 待测样本数 +HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品） 向离心管中各加入10 ul内标溶液，再分别加入200ul样本，800 ul RNA提取液B，盖紧管盖，振荡混匀15s以充分混匀，室温放置5min（每隔1min旋涡振荡5s，使裂解更充分，处理结束后瞬时离心。） 加入200 ul无水乙醇7、，盖紧管盖，漩涡振荡混匀15s以充分混匀，瞬时离心，再加入20 ul RNA提取液A，漩涡振荡混匀5s，室温静置1min。8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。 再加入200 ul RNA提取液B，盖紧管盖，充分混匀（用移液枪吹打），室温下8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。 加预冷的75%乙醇400ul充分混匀，8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。7.2.9加预冷的75%乙醇400ul充分混匀，8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。7.2.10 打开管盖，放入金属浴，65干燥5 min，使液体挥发完全。 温育5min后，用镊子从金属浴中取出离心管，加入50 ul 8、DEPC H2O，用移液枪吹打混匀，室温静置1min后，8000 rpm离心1min。离心管内的上清液即为病毒核酸溶液，建议立即使用，如需保存，置于-70。7.2.13 取出已分装好的PCR反应管，向对应编号的PCR管中加入处理好的的样品（包括待测标本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品）上清液各20 ul，空白对照不加模板，盖紧反应管。8000rpm离心数秒，经传递窗移至扩增检测区。（用移液枪小心吸取上清液，尽量不要碰到底层沉淀。）7.3 PCR扩增（扩增区）7.3.1 从传递窗中取出PCR反应管，放入仪器样品槽内。7.3.2 在“Set up”按对应顺序设置空白管、阴性质控品、阳性室9、内质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品及待测标本，并在“sample name”一栏中设置样本名称，探针检测模式设置：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC，Quencher Dye2：none；Passive Reference：NONE。具体设置方法参考AB 7500核酸扩增仪标准作业指导书。7.3.3 打开“Run Method”窗口设置循环条件：50 15 min，1个循环；95 5min ，1个循环；94 15s 55 45 s（收集荧光）， 45个循环；7.3.4 保存文件，运行仪器。8. 结果分析8.1 反应10、结束后，操作人员可根据实际情况自行调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值。Start值可以在3-15，End值可设在5-20。在Log图谱窗口设置的Threshold的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线。点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面查看结果，记录样本数值（C）。8.2 如果反应体系扩增曲线在FAM检测通道无明显对数增长期，且在VIC检测通道有对数增长期，则判定样品的HCV RNA阴性。8.3 如果反应体系扩增曲线在FAM、VIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道CT45；或者扩增曲线在11、FAM检测通道有对数增长期且CT45 ，在VIC检测通道无对数增长期，则判定样品的HCV RNA阳性性。9. 质量控制每次实验均需检测阴性质控品、HCV 强阳性质控品、HCV临界阳性质控品。质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判断。9.1 试剂盒自带质控（1）阴性质控品：FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期，VIC检测通道扩增曲线有明显对数增长期。（2）HCV 阳性质控品：FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期，且强阳性质控品FAM检测通道CT30，临界阳性质控品FAM检测通道36。（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S型曲线，且0.97r1。9.2 室内质控每次实验应选择适当的HCV12、 RNA质控品做室内质控。9.3 以上要求（9.1和9.2）需在同一次实验中同时满足，否则，本次试验无效，需从新进行。10. 干扰因素10.1 环境中存在RNase，可降解RNA，导致实验结果假阴性，因此实验过程应戴手套，帽子，防止皮屑、毛发等的RNase，实验用品需高压灭菌后使用，尽量避免污染。 10.2 临床标本中内源性抑制物：血红蛋白、免疫球蛋白、白细胞内乳铁蛋白、脂类、等都可抑制PCR反应，标本应避免溶血、脂血、黄疸等。10.3 外源性抑制物：肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、手套上的滑石粉、标本容器上的抑制物等，标本应按采集要求采集，操作中应小心谨慎，标本容器及实验用具应鉴定合格。1013、.4 标本的交叉污染：操作过程中应细心认真，防止交叉污染，尽量使用带鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取，以及时发现交叉污染。11. 生物参考区间： 1.0102 IU/ml1.0108 IU/ml12. 警示/危急值：HCV RNA检测无警示/危急值。13. 异常结果处理如遇HCV RNA检测结果与临床诊断或资料，或与近期历史检测结果不相符合，应及时与临床医生联系、沟通，查找原因并采取措施，于疑问报告发放处理记录表中记录处理过程。如需复查，需及时保存标本。14. 临床意义HCV感染诊断的指标，指导临床治疗。15. 变异的潜在来源标本保存不当或反复冻融，都会影响检测结果的准确。16.14、 注意事项16.1 实验过程中必须穿专用工作服、戴手套、口罩、帽子、必要时戴防护眼罩，接触标本后必须及时更换手套。16.2 阳性质控品和检测样本均应视为具有传染性物质，应避免接触到皮肤和粘膜。16.3 实验过程必须严格分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用。16.4 样品的处理操作应在生物安全柜内进行。16.5所用检测试剂使用前应完全解冻，瞬时离心后使用，应避免反复冻融。16.6 样本核酸提取后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于-20待用（24 h）。16.7 操作过程中应防止交叉污染，尽量使用鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取。16.8 加样时应使样品完全落入反应液中，不应15、有样品粘附于管壁上，尽快盖紧管盖。上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。16.9 标本制备区所用到的试管、吸头等需打入盛有消毒剂的容器，并与废物一起灭菌后方可丢弃。16.10 扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。16.11 实验中用过的吸头请直接打入盛有10%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。16.12 每次实验均应有质量控制。16.13 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精处理工作台和移液枪，然后用紫外线灯照射30 min。17. 记录保存与丙型肝炎病毒核酸定量相关的使用维护保养要如实详细记录，并按要求定期归档保存。18. 参考文献xx大学xx基因丙型肝炎病毒核酸定量检测（PCR-荧光探针法）试剂盒说明书