1、X XX X市市动动物物病病原原微微生生物物与与免免疫疫学学重重点点实实验验室室新型冠状病毒肺炎快速等温扩增检测试剂盒技术开发背景检测方法介绍合作开发前景目前新冠肺炎核酸检测（RT-qPCR法）存在问题核酸检测操作繁琐结果等待时间长需要精密昂贵仪器和高素质操作人员难以在基层检测机构推广和普及亟需开发特异性强、敏感性高兼具高效、快捷、可视化的检测产品（技术)，用于医院、社区和居家隔离、环境检测的有效补充。环介导等温扩增技术灵敏度高（比传统的PCR方法高2-5个数量级）反应时间短（30-60 min）不需要特殊的仪器操作简单新型冠状病毒新型冠状病毒RT-LAMP检测方法的建立检测方法的建立LAMP2、引物设计：以新型冠状病毒（SARS-CoV-2）参考毒株Wuhan-Hu-1核衣壳编码基因N为模板，应用LAMP专用设计软件PrimerExplorer V5 设计了5套引物（1#、7#、15#、19#、22#）以N基因作为阳性对照，建立了环介导等温扩增检测方法。经验证，引物19#和22#可扩增到目的条带，得到较好的显色，可作为潜在检测引物。RT-LAMP反应条件优化应用引物22#建立的RT-LAMP反应体系：40 pmol FIP&BIP 5 pmol F3&B320 pmol FLP&BLP1.4 mM dNTPs 0.8 M betaine20 mM Tris-HCl,pH 8.8,103、 mM KCl10 mM(NH4)2SO48 mM MgSO40.1%TritonX-100 8 units Bst DNA pol.200 units SuperScript IV RTase 60、25min是本检测体系的最佳反应条件。从5 copies/L至103 copies/L拷贝数浓度的RNA均可以观察到阳性反应，拷贝数浓度为5 copies/L的RNA反应时有肉眼可见的变色反应，具有检测灵敏的优点。敏感性选取7种常见呼吸道病毒对照物为特异性检测受试病毒，应用建立的环介导等温扩增反应，确定反应特异性。建立的新型冠状病毒检测方法，仅能检测出SARS-CoV-2 N基因转录物，而其他其4、中常见冠状病毒扩增结果均为阴性，显示了本方法良好的特异性。特异性特异性NATtrolRespiratoryValidationPanel3本检测试剂盒特色磁珠法提取RNA，不用配套离心机等仪器，对检测平台要求低。一步法扩增，反转录和扩增步骤同步进行，操作简便。核酸检测染料内置于反应管盖内侧，避免因开盖带来的气溶胶污染。经对比分析发现，本方法与RT-qPCR方法的阳性符合率为88.3%(5/6)；阴性符合率为100%(12/12)；弱阳性符合率为10%(1/10)，检测时阴性对照和阳性对照组也均符合预期。临床检测对比应用该试剂盒对常规新冠病毒核酸检测的4644例样本进行了初步筛查，结果显示该方法的临床符合率与RT-qPCR方法符合率为100%。临床初步应用疫病流行期敏感场所空气中病毒含量的监测与消毒对疫病防控至关重要。隔离场所，特别是疑似患者隔离所、定点医院和方舱医院，尤为突出，院内感染已成为重点防控关键环节，更增加了解决环境污染问题的紧迫性。应用场景本检测试剂盒可快速地从血液、拭子、痰液、空气等样本中检测新型冠状病毒核酸，具有简便、快速，不需要大型仪器和专业人员培训的优点，可以用于可疑患者的快速临床初次筛查，又可以进行环境空气质量监测，在迅速出具检测结果的同时，极大降低了检测成本和技术难度。感谢关注，请多提宝贵意见！