1、深圳市预防和控制人感染高致病性禽流感应急工作预案(卫生部分)（2005年修订）目 录1总则11目的12编制依据13工作原则14适用范围2组织管理与职责21各机构职责22医学专家委员会及各专家指导小组职责3疫情分级和预警31一般疫情（IV级，蓝色预警）32较大疫情（III级，黄色预警）33重大疫情（II级，橙色预警）34特别重大疫情（I级，红色预警）4应急响应级别和启动41三级响应42二级响应43一级响应44扩大应急 45应急结束5后期处置51评估52善后处理53调查和总结54督导检查6附则61制定与解释62实施时间1总则11目的为预防和控制人感染高致病性禽流感在深圳市的发生和流行，做好疫情监测2、预警，减低人类受感染的风险，加强应对疫情的各项准备工作和应变措施，提高应急反应能力，及时有效地控制和消除疫情，保障市民身心健康和生命安全，维护社会稳定和经济发展，特制定本预案。 12编制依据根据中华人民共和国传染病防治法、国务院突发公共卫生事件应急条例、中华人民共和国传染病防治法实施办法、卫生部应对流感大流行准备计划与应急预案、深圳市人民政府突发公共事件总体应急预案和深圳市突发重特大传染病（含不明原因疾病）疫情应急预案等法律法规及相关指导性文件制定本预案。13工作原则131预防为主、防治结合坚持预防为主的工作方针，积极组织落实应对疫情的各项准备工作。充分利用全市疫情监测报告网络的作用，加强疫3、情的日常监测和疫情报告工作，做到“早发现、早报告、早隔离、早治疗”，认真落实预防控制措施。132统一领导、属地管理各级人民政府统一领导本辖区的人感染高致病性禽流感工作；按照属地管理原则，实行市、区、街道办事处、社区工作站（社区居委会）四级负责制，共同做好人感染高致病性禽流感的预防控制工作。133常备不懈、快速反应加强防治专业队伍的培训和应急演练，储备充足的应急物资，保证信息渠道的畅通；发生人感染高致病性禽流感疫情后，能够迅速采取有效的预防控制和医疗救治措施，控制传染源，切断传播途径，保护易感人群，及时救治病人和疑似病人，控制和隔离密切接触者。134依法管理、依靠科学严格执行国家有关法律法规，对4、人感染高致病性禽流感的预防、疫情报告、控制和救治工作实行依法管理；对于违法行为，依法追究责任。贯彻依靠科学技术战胜人感染高致病性禽流感的方针，实施科学防治。积极研制和科学应用检测试剂、疫苗、药物等，切实加强临床治疗方案及流行病学研究，规范防控措施与操作流程，实现防治工作的科学化、规范化。14适用范围本预案适用于应对深圳市发生人感染高致病性禽流感疫情的准备工作及疫情发生和流行后的应急处理工作。2组织管理与职责21各机构职责211深圳市卫生行政部门市卫生局是市卫生系统预防和控制人感染高致病性禽流感工作的主管单位，下属突发公共卫生事件应急处理办公室是日常办事机构，各区卫生局在本辖区范围内负责主管相关5、工作。负责组织制定医疗救治、预防控制等应急方案并组织实施；及时向上级部门报送疫情信息；向社会发布疫情信息；组织、协调、指挥卫生技术专家或应急队伍及时评估临床治疗病人的控制效果，检查各种预防措施，进一步完善各项防治方案；开展有关传染病防治科普知识的宣传等工作。根据专家委员会发布的预警和建议，市卫生局确定启动相应级别应急响应并上报市政府及省卫生厅。212疾病预防控制机构负责建立人感染高致病性禽流感监测网络，监测、分析并报告疫情状况；核实疫情，提出疫点和疫区划定、启动、终止建议并参与实施消毒隔离等防治措施；承担病原体的实验室检测和技术支持；建立紧急疫情控制物资储备库，储备消杀药品、检测试剂、器械、防6、护用品等；对疫情预防控制措施效果进行评估，提出改进建议；建立心理应激救援工作机制；做好预防控制人员的技术培训；积极开展卫生宣传和健康教育。213医疗机构成立医院防病工作领导小组，制定院内工作流程；协同市医疗救护专家指导小组开展工作，负责病人的诊断、报告、治疗和收治管理工作，不断完善治疗方案；每日报告收治病人的动态情况；加强医疗机构内的消毒隔离工作和医护人员的个人防护，防止医源性感染，预防疾病传播；开展有关业务培训和指导；做好有关卫生宣传和健康教育工作。214卫生监督机构负责监督落实疫点、疫区预防控制措施，收治病人医疗机构消毒隔离和医务人员个人防护等措施；开展对医疗机构、食品生产经营单位、学校、7、托幼机构和公共场所等区域的消毒隔离、传染病报告工作的监督检查；对违反中华人民共和国传染病防治法和突发公共卫生事件应急条例的行为实施行政处罚；会同疾病预防控制机构做好卫生宣传教育工作。215健康教育机构搞好健康教育和健康促进，普及人感染高致病性禽流感和其他相关传染病的防治知识，提高群众卫生防病的意识和自我保健的能力。216社区健康服务中心协助疾病控制机构做好密切接触者的医学观察及病人出院后的随访工作；指导开展环境消毒和社区居民个人防护；开展居民健康教育；发现可疑病人要及时报告。217市医疗急救中心准备专用救护车和急救人员，负责病人转运。按市卫生局规定的责任区域调度指挥指定救护车运送患者。22医学8、专家委员会及各专家指导小组职责221深圳市医学专家委员会深圳市医学专家委员会（以下简称专家委员会）依照疫情分级标准，并结合疫情发展趋势、疫情波及范围和影响大小等情况进行综合性评估，发出疫情预警报告，并立即报告市卫生局。222医疗救护专家指导小组负责全市人感染高致病性禽流感病例的临床确诊、救治工作，指导各级医疗卫生单位人感染高致病性禽流感可疑病人的诊断工作。223流行病学调查技术指导小组负责全市人感染高致病性禽流感疫情报告、流行病学现场调查和疫点调查的技术支持。224消毒杀虫技术指导小组负责指导全市各级医疗卫生单位的消毒隔离技术支持和院内消毒效果强化检测，指导医务人员做好自身防护工作；负责疫点的9、随时和终末消毒工作以及相关技术支持。225病原学检测技术指导小组负责病原学标本的采集、运送、检测工作，以及各级医疗卫生、疾病控制机构实验室检测工作的技术咨询和指导。3疫情分级和预警按照人感染高致病性禽流感疫情发生和流行的性质、危害程度和波及范围，将疫情划分为一般（级）、较大（级）、重大（级）和特别重大（级），依次用蓝色、黄色、橙色和红色进行预警。31一般疫情（IV级，蓝色预警） 我市周边国家、省或地区发生禽类高致病性禽流感疫情，我市范围内未发现疫情。32较大疫情（III级，黄色预警）我市范围内出现疑似或确认禽类高致病性禽流感疫情，但没有发现人感染高致病性禽流感病例；或在我市周边国家、省或地区证10、实出现人感染高致病性禽流感病例，但无证据显示病毒容易在人与人之间传播。33重大疫情（II级，橙色预警）我市范围内出现散在的疑似或确诊人感染高致病性禽流感病例，但无证据显示病毒容易在人与人之间传播；或有证据确定我市周边国家、省或地区人感染高致病性禽流感疫情的病毒具备在人与人之间传播的能力。34特别重大疫情（I级，红色预警）我市范围内证实人感染高致病性禽流感疫情的病毒具备在人与人之间传播的能力，有可能出现暴发或流行。4应急响应级别和启动41三级响应经专家委员会评估，确认发生IV、III级疫情，并发出预警后，市卫生局启动三级应急响应。411防控措施在坚持日常防控措施的基础上，进一步采取以下措施：加强11、疫情信息的收集和通报，与周边国家、省或地区和农业部门保持紧密联系，密切关注高致病性禽流感和人感染高致病性禽流感疫情动态。对动物疫点内的人员进行应急监测和应急接种。实施必要的隔离控制和医学观察措施，行分散隔离或集中隔离，由疫点所在地的区疾控中心和附近的社区卫生服务中心负责组织对实。市、区疾控中心开展流行病学调查，追访传染源，对疫点进行消毒。对密切接触者、防控工作人员和准备投入救治工作的医护人员提供应急接种。卫生监督部门加大对门（急）诊传染病报告制度执行情况的监督检查力度；会同有关部门对建筑工地和民工生活区、出租房屋、地下空间、宾馆、饭店、商场、文化娱乐及人口密集场所、交通路口等公共场所进行监督检12、查，加强通风换气，并采取必要的消毒措施。加强对民营医疗机构和个体门诊部、诊所的传染病报告、消毒隔离工作和个人防护措施的监督检查。全市保持正常工作、生产和生活秩序。411医疗救治各区以上卫生行政部门指定具备收治传染病病人能力的医院作为人感染高致病性禽流感疫情病人的定点救治医院。各医院成立医疗救治专家小组，根据市医疗救护专家指导小组提出的治疗方案和工作指引，做好应急的各项准备工作和演练。指定专职人员负责疫情报告工作，切实做好医院感染控制工作；加强门（急）诊空气流通和消毒防护工作；加强医务人员防护，防止医院交叉感染发生。随时准备接受病人。储备医疗救治、抗病毒和消毒药物，储备消毒器械和个人防护用品。413、2二级响应经专家委员会评估，确认发生II级疫情，并发出预警后，市卫生局启动二级应急响应。 421防控措施在坚持三级响应的防控措施的基础上，进一步采取以下措施：对所有人感染高致病性禽流感疫情发生地点和密切接触人群实施隔离控制措施，对一般接触者实行医学观察。重点人群进行应急预防接种，优先考虑保护为社会提供基本服务的人群和老人、儿童等高危人群。民航、公路、铁路、长途客车站、重要交通路口增加检疫站（点），对进出深圳人员进行全面的防疫检查。公共场所、公共交通工具和人员集中的地区定时进行消毒。宾馆、饭店、各类文化娱乐场所等一旦发生疫情，立即停业，并配合市或区CDC做好消毒、流调等工作。中小学、高等院校发生14、疫情，校方须配合疾病预防控制机构开展落实各项防控措施，如需停课，报请上级教育行政部门批准。各街道、社区启动相应的二级应急预案。相关疫区范围内启动各自的工作网络，防止疫情扩散和蔓延。发生疫情的街、社区采取分组包片的办法，确定联系对象，工作涵盖辖区全体居民。市民外出应采取必要的个人防护措施，并定时进行居所消毒，搞好楼道卫生；定时测量体温，如有异常立即向工作单位以及居住地的社区居委会报告，并到发烧门诊就诊，也可以拨打120急救电话求助。发生疫情的单位和居住区的居民要配合疾病控制部门做好隔离控制工作。市政府派出督导组，对各项防治工作进行全面监督检查。市、区卫生监督所负责监督落实疫点、疫区预防控制措施，15、监督有关医疗机构落实消毒隔离和医务人员防护措施，检查人口密集公共场所疫情防控工作。除实施隔离控制的疫情地点及相关人群外，其他单位和居民均应正常工作、生产和生活。422医疗救治 接到收治人感染高致病性禽流感疫情病例的指令，医疗机构应快速、有序地携带必须的医疗药械及个人防护用品等赶赴现场开展工作。医院应拟定救治方案，并将每天救治病例的情况向市医疗救护指导小组报告。及时补充医疗救治和消毒所需的各种物资。43一级响应经专家委员会评估，确认发生I级疫情，并发出预警后，市卫生局经市应急指挥中心报请市处置突发事件委员会后，启动一级应急响应。431防控措施在坚持二级响应防控措施基础上，进一步采取以下措施：各有16、关部门和单位、街道、社区居委会配合各级疾病控制中心做好对疫情地点和场所的隔离控制，做好后勤保障和群众的思想政治工作。市、区疾病控制中心按照有关规定，做好对人感染高致病性禽流感疫情的确诊及疑似病例、密切接触者的隔离控制工作。开展大范围的应急接种工作，免疫覆盖率力争全市常住人口的85%以上。在所有进深圳的交通路口设立检疫检查站（点）。在机场、火车站、省际长途汽车站和公路检查站设立联合检查组，实施防疫检查；所有进出深圳的乘客填写健康登记卡，并接受体温测量；发现有发热症状的乘客，要送留观站；对疑似病人由卫生部门及时送定点医院；对与疑似病人同舱或同一车厢的乘客由流行病学调查组进行追访、医学观察并隔离。对17、拒不接受体温测量或留观诊断并经劝阻无效者，由公安机关依法采取必要的强制措施。全市各宾馆、饭店、旅馆、招待所要严格执行入住旅客填写健康登记卡制度，并对驻店客人每天测量体温，发现可疑病人，及时向所在区疾病控制中心报告。各级各类学校每天坚持对学生测量体温，定时对教室、实验室、食堂和学生宿舍等公共场所进行消毒，取消一切人员过于集中的大课和大活动；实行停课的中小学必须每天坚持跟踪了解学生身体状况，教育学生在家学习和休息。学生未经批准不得离校；健康状况不佳的学生，家在农村地区、西部地区或疫区的学生，不予批准离校。对所有离校的大学生，学校要跟踪了解学生的健康状况，并纳入学校疫情监控和信息报告范围；离校后又返18、校的学生，必须进行隔离观察。建筑工地实行封闭式管理。对工地与住地分开的，要建立安全通道，上下班由班车接送。建立24小时运转的监控网络，对施工现场和工棚进行检查，对民工宿舍、食堂、厕所逐一定时、定点消毒。各用人单位不得擅自停工停业和遣散民工。各单位停止组织全国性的和跨省、跨地区的大型会议和活动，已安排的大型活动（包括各类演出等）原则上取消或推迟关闭网吧、电子游戏厅、录像厅、剧场、影院、图书馆、博物馆、文化馆（站）、体育场（馆）等公益性文化体育设施，必须逐一落实通风、消毒等措施，并建立来访或参观者登记制度。全市各区和各级各类医疗机构所拥有的专用急救车辆，统一归市120急救中心指挥，市应急指挥部派出19、专人督导落实急救、转运工作，任何单位或个人不得以任何理由拖延或推诿。明确医院院长负总责制度，对于推诿、拒收、对病人不负责任的医院严厉追究责任。市和区120急救中心应与各医院密切配合，对于需要就诊和转诊的病人确保做到随叫随到，严防病人在自行求诊中造成传染。432医疗救治启用市第三人民医院。市第三人民医院在接到市处置突发事件委员会的命令后24小时内人员全部到位，做完各项准备工作，具备接收患者条件。支援医院（深圳铁路医院或指挥部临时决定的其他支援医院）在接到市处置突发事件委员会支援命令后24小时内完成各项准备工作，按要求派出增援人员和设备，到达指定医院。根据市应急指挥中心的统一调配，划拨各项救治物资20、。44扩大应急 当突发疫情难以控制或有扩大、发展趋势时，卫生系统应做好进一步的应对计划，主要有：扩大后备定点收治隔离病人医院名单的确定；卫生系统各专业队伍的后备队组织；物资储备的调运与扩充；全市医务人员调遣、全市范围内现有医院及装备征用等，调整疫情控制工作方案。市处置突发事件委员会及时上报，请求党中央、国务院或省委、省政府支援和指挥。45 应急结束本次疫情的末例治愈病人出院，经过一个最长潜伏期仍无新的病人发生，经专家委员会讨论，由深圳市卫生局报请深圳市处置突发事件委员会批准，解除封锁。本次应急响应即可结束。5后期处置51评估应急响应结束后，市、区卫生行政部门组织对疫情处理情况进行初步评估。评估21、内容包括疫情的危害、现场调查处理情况、疫苗和药物使用情况、病人救治情况、措施效果评价、应急处理过程中存在的问题和取得的经验及改进建议。评估报告上报市人民政府和省卫生厅。52调查和总结疾病控制机构对传染病疫情全过程进行回顾性流行病学调查和分析，总结经验教训，为指导今后的传染病防制工作提供指导依据。各级医疗机构对自身的工作进行总结和检讨，堵塞漏洞，防患于未然。各级有关卫生部门要作好有关总结工作，各区卫生行政部门在结束响应7日内将书面总结报市卫生行政部门。市卫生局将疫情工作报告报市应急指挥中心等有关部门。53 督导检查市、区卫生行政部门定期派出督查组，对辖区的传染病防控工作进行督导、检查。卫生专业执22、法部门加强后期传染病的防疫和卫生执法监督。对监督检查中发现的防治措施不力、出现明显疏漏的，要按照有关规定作出严肃处理，并责令被检查单位限期整改。6附则61制定与解释本预案有深圳市卫生局负责制定、定期修订和解释。62实施时间 本预案自公布之日起开始实施，以前发布的相关预案同时废止。 附件： 1、深圳市卫生系统人感染高致病性禽流感防治领导小组及各技术指导小组 2、深圳市人感染高致病性禽流感疫点、疫区划分原则 3、深圳市人感染高致病性禽流感临床诊断标准 4、深圳市人感染高致病性禽流感推荐治疗方案 5、深圳市人感染高致病性禽流感流行病学调查及疫情控制指引 6、深圳市人感染高致病性禽流感消毒指引 7、流23、感样标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输指引 8、流感病毒实验室检验技术指引 9、流感监测实验室生物安全规定附件1：深圳市卫生系统人感染高致病性禽流感防治领导小组组 长：江捍平 市卫生局局长副组长：张 丹 市卫生局副局长 许四虎 市卫生局副局长成 员：谢若斯 市卫生局医政处处长陈广钦 市卫生局办公室主任张英姬 市卫生局卫生防疫处处长刘 堃 市卫生局应急办主任李 林 市卫生局医政处主任科员 田永张 市卫生局应急办主任科员 张 欣 市卫生局应急办副主任科员 连振辉 罗湖区卫生局局长 罗乐宣 福田区卫生局局长 杨志学 南山区卫生局局长 曾晓莲 盐田区卫生局局长 陈金喜 宝安区卫生局局长 段小贝 24、龙岗区卫生局局长职责：负责指挥、协调和联系。深圳市医学专家委员会深圳市医学专家委员会由医疗救护专家指导小组、流行病学调查技术指导小组和实验室检测指导小组的组长、副组长组成。深圳市人感染高致病性禽流感流行病学调查技术指导小组组 长：张英姬 深圳市卫生局防疫处 处长副组长：张顺祥 深圳市疾控中心 副主任成 员：马汉武 深圳市疾控中心流行病科 主任 主任医师谢 旭 深圳市疾控中心流行病科 副主任 主管医师 王 昕 深圳市疾控中心流行病科 医师 陈戊申 罗湖区疾控中心防疫科 主任 黄慈林 福田区疾控中心疾控一科 主任 戴传文 南山区疾控中心疾控办 主任 吴泰顺 宝安区疾控中心防疫科 主任 张启文 龙岗25、区疾控中心防疫科 主任 黎大林 盐田区疾控中心防疫科 主任职责： 1、负责全市人禽流感疫情报告和现场调查及疫源地处理。 2、负责人禽流感调查资料分析，提出防制对策并考评效果。 3、负责全市人禽流感回顾性调查实施和资料分析。4、提供其它技术支持。深圳市人感染高致病性禽流感病原学检测技术指导小组组 长：庄志雄 深圳市疾控中心 主任副组长：刘小立 深圳市疾控中心 副主任成 员：何建凡 深圳市疾控中心微检科 副主任 扈庆华 深圳市疾控中心微检科 副主任技师 何雅青 深圳市疾控中心微检科 副主任技师 程小雯 深圳市疾控中心微检科 副主任技师 李卓成 市二医院 副主任技师 盖俊惠 市二医院 副主任技师 何26、 林 市人民医院 副主任技师 罗贵有 市人民医院 副主任技师 刘小平 北大深圳医院 副主任技师 王 德 北大深圳医院 主管技师 单万水 市东湖医院 副主任技师职责： 1、负责全市医疗卫生单位人禽流感病例样本检测、病原体分离培养和鉴定。 2、负责全市医疗卫生单位人禽流感病例样本检测技术咨询指导。3、提供其它相关技术支持。深圳市人感染高致病性禽流感消毒技术指导小组组 长：张顺祥 深圳市疾控中心 副主任副组长：张韶华 深圳市疾控中心消杀科 主任成 员：朱子犁 深圳市疾控中心消杀科 主管技师 梁焯南 深圳市疾控中心消杀科 副主任技师 陈戊申 罗湖区疾控中心防疫科 主任 黄慈林 福田区疾控中心疾控一科 27、主任 戴传文 南山区疾控中心疾控办 主任 吴泰顺 宝安区疾控中心防疫科 主任 张启文 龙岗区卫生防疫站防疫科 主任 黎大林 盐田区卫生防疫站防疫科 主任职责： 1、负责全市医疗卫生单位医院内消毒效果强化监测； 2、负责人禽流感病例疫源地随时和终末消毒； 3、负责全市有关单位及人群消毒知识咨询服务； 4、提供其它相关技术支持。深圳市人感染高致病性禽流感医疗救护专家指导小组组 长：邱 晨 主任医师 市人民医院副组长：杨大国 主任医师 市东湖医院 吴诗品 主任医师 市人民医院 袁本通 主任医师 市第二人民医院 宋卫东 副主任医师 北大深圳医院 高 雪 主任医师 市中医院职责：负责医疗救护的诊断、治疗28、技术指导。 联系人：谢若斯：25620990 26115082通 讯 录姓 名办公电话移动电话江捍平张 丹许四虎陈广钦谢若斯张英姬刘 堃李 林田永张张 欣连振辉罗乐宣杨志学曾晓莲陈金喜段小贝庄志雄刘小立张顺祥马汉武张韶华何建凡谢 旭朱子犁梁焯南王 昕扈庆华何雅青程小雯陈戊申黄慈林戴传文吴泰顺张启文黎大林邱 晨杨大国吴诗品袁本通宋卫东高 雪李卓成盖俊惠何 林罗贵有刘小平王 德单万水附件2：深圳市人感染高致病性禽流感疫点、疫区划分原则 一、疫点 疫点是指发生人禽流感病人所在地点，一般是指患者生活、工作的场所。 二、疫区 疫区是根据疫情可能涉及的范围、疫点的地理位置、水系分布、交通情况、自然村落等来29、划定疫区，一般在农村以一个村或几个村、一个镇或毗邻镇，在城市以一个或几个居委或一个街道为范围划分为疫区。 疫区由疫区所在辖区向市人民政府提出申请，经市人民政府同意后发布。附件3：深圳市人感染高致病性禽流感临床诊断标准（一）诊断 根据流行病学接触史、临床表现及实验室检查结果，可作出人禽流感的诊断。流行病学接触史在诊断中具有重要意义。 1.流行病学接触史 （1）发病前1周内曾到过疫点，有感染禽流感病毒的可能。 （2）与被感染的家禽及其分泌物、排泄物等有密切接触史者。 （3）与禽流感患者有密切接触史者有患病的可能。 2.诊断标准 （1）医学观察病例有流行病学接触史，1周内出现流感样临床表现者。 与人30、禽流感患者有密切接触史，在1周内出现流感样临床表现者。 对于被诊断为医学观察病例者，医疗机构应及时报告当地疾病预防控制机构（按预警病例报告），并对其进行7天医学观察。 （2）疑似病例有流行病学接触史和临床表现，患者呼吸道分泌物标本甲型流感病毒H亚型抗原检测阳性或核酸检测阳性者。 （3）确诊病例有流行病学接触史和临床表现，从患者呼吸道分泌物标本中分离出特定病毒或采用RT-PCR法检测到禽流感H亚型病毒基因，且发病初期和恢复期双份血清抗禽流感病毒抗体滴度4倍或以上升高者。 （二）鉴别诊断 临床上应注意与流感、普通感冒、细菌性肺炎、传染性非典型肺炎（SARS）、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、31、衣原体肺炎、支原体肺炎、肺炎型流行性出血热等疾病进行鉴别诊断。鉴别诊断主要依靠病原学检查。附件4：深圳市人感染高致病性禽流感推荐治疗方案（一）对疑似和确诊患者应进行隔离治疗。 （二）对症治疗可应用解热药、缓解鼻粘膜充血药、止咳祛痰药等。儿童忌用阿司匹林或含阿司匹林以及其它水杨酸制剂的药物，避免引起儿童Reye综合征。 （三）抗病毒治疗应在发病48小时内试用抗流感病毒药物。 1.神经氨酸酶抑制剂奥司他韦（Oseltamivir，达菲）为新型抗流感病毒药物，实验室研究表明对禽流感病毒H5N1和H9N2有抑制作用，成人剂量每日150mg,儿童剂量每日3mg/kg，分2次口服，疗程5天。 2.离子通道32、M2阻滞剂金刚烷胺（Amantadine）和金刚乙胺（Rimantadine）可抑制禽流感病毒株的复制，早期应用可能有助于阻止病情发展、减轻病情、改善预后，但某些毒株可能对金刚烷胺和金刚乙胺有耐药性。金刚烷胺成人剂量每日100200mg，儿童每日5mg/kg，分2次口服，疗程5天。肾功能受损者酌减剂量。治疗过程中应注意中枢神经系统和胃肠道副作用。老年患者及孕妇应慎用，哺乳期妇女、新生儿和1岁以下婴儿禁用。金刚乙胺的毒副作用相对较轻。 （四）中医药治疗 1、辨证论治 （1）轻证毒犯肺胃 症状：发热，恶寒，咳嗽，少痰，咽痛，头痛，肌肉关节酸痛，部分患者伴有恶心，呕吐，腹泻，舌苔白、白腻或黄腻，脉浮33、滑数。 病机：疫毒之邪袭于肺胃，致肺胃蕴邪，肺失宣肃，胃肠失和，湿热壅滞。 治法：清热解毒，宣肺化湿，调和胃肠。 参考处方： 桑叶菊花炒杏仁黄连 连翘知母生石膏藿香 佩兰苍术姜半夏芦根 加减：口干者加沙参； 咳嗽甚者加枇杷叶、浙贝母； 苔腻甚者加草果； 恶心呕吐者加竹茹、苏叶； 腹泻者去知母，加马齿苋。 （2）重证疫毒壅肺，内闭外脱 症状：高热，寒战，咳嗽，少痰难咯，胸痛，憋气喘促，口唇紫暗，或心悸，四末不温，冷汗淋漓，躁扰不安，甚则神昏谵语，舌暗红苔黄腻或灰腻，脉细数或脉沉细欲绝。 病机：疫毒之邪壅肺，热毒壅盛，故高热，寒战；肺失宣降，故喘息憋气；痰瘀闭肺，肺气欲绝，故呼吸极度困难，喘息气促34、，阳气欲脱，可见心悸、心慌，四末发冷，冷汗淋漓等。 治法：清肺解毒，扶正固脱。 参考处方： 炙麻黄生石膏炒杏仁知母 川贝母鱼腥草黄芩葶苈子 虎杖西洋参山萸肉炙甘草 加减： 高热、神志恍惚，甚则神昏谵语者上方送服安宫牛黄丸（或胶囊），也可选用清开灵、醒脑静、鱼腥草注射液。 肢冷、汗出淋漓者去川贝母，加桂枝、干姜、炮附子、煅龙骨、煅牡蛎，注射剂可选用生脉注射液、参麦注射液、参附注射液、黄芪注射液等。 口唇紫绀加三七、益母草、黄芪、当归尾； 苔黄腻甚者加藿香、佩兰、黄连。 2、中成药应用应当辨证使用口服中成药或注射剂，可与中药汤剂配合应用。 （1）解表清热类：可选用柴银口服液、银黄颗粒等。 （2）清35、热解毒类：可选用双黄连口服液、清热解毒口服液（或颗粒）等。 （3）清热开窍类：可选用安宫牛黄丸（或胶囊）、清开灵口服液（或胶囊）等。 （4）清热祛湿类：可选用藿香正气丸（或胶囊）、葛根芩连微丸等。 以上4类均可选用清开灵注射剂、醒脑净注射液、鱼腥草注射剂、双黄连粉针剂等。 （5）扶正固脱类：可选用生脉注射液、参麦注射液、参附注射液、黄芪注射液等；也可配合使用生脉饮口服液、百令胶囊、金水宝胶囊等。 （五）加强支持治疗和预防并发症注意休息、多饮水、增加营养，给易于消化的饮食。密切观察，监测并预防并发症。抗菌药物应在明确继发细菌感染时或有充分证据提示继发细菌感染时使用。 （六）重症患者的治疗重症患者36、或发生肺炎的患者应入院治疗，对出现呼吸功能障碍者给予吸氧及其他相应呼吸支持，发生其它并发症的患者应积极采取相应治疗。附件5深圳市人感染高致病性禽流感流行病学调查及疫情处理指引一、目的流行病学调查是传染病预防控制的关键措施和重要工作环节。做好人禽流感流行病学调查对于指导疫情的预防和控制至关重要，其主要目的是：1核实诊断，查找传染源和传播途径；2追踪和管理病例的密切接触者，防止疾病的进一步传播；3掌握疫情的动态变化和影响因素，为疫情发展趋势的科学预测提供数据；4监测和评价疫情预防和控制措施落实情况和效果，发现疫情控制工作的薄弱环节，为疫情控制工作的指挥、决策和实施提供信息支持，为制定和完善疫情控制37、策略和措施提供科学依据；5为最终阐明疾病自然史、流行病学特征及规律提供研究线索，为今后应对类似突发不明原因疾病积累经验。二、工作内容1病例的个案调查2接触者追踪和管理3. 疫情处理措施4资料管理和利用三、工作程序和方法（一）病例的个案调查。1病例的报告。各级各类医疗卫生机构要密切注意就诊人员，严格按照人禽流感的诊断标准的要求，发现病人或疑似病人后，以最快的方式向当地疾病预防控制机构报告疫情，同时填写深圳市甲乙丙类传染病报告卡，在备注栏应注明“人禽流感”。2接到人禽流感病例（和疑似病例）报告后，报告病例的医疗机构所在地的区级疾病预防控制机构要在最短时间内派出流行病学调查人员，对报告病例进行流行病38、学个案调查。每个病例的调查原则上要由两人共同完成。同时，派出消毒专业人员到病家和病人的其它滞留地点进行终末消毒。3对病例进行个案调查时，尽可能由病人自己回答调查者所提的问题，收治病人的医疗机构和医护人员要积极配合，并如实提供病人相关诊疗资料。如病人因病情较重或已死亡，无法实施对病人的直接调查时，应通过其亲友、同事或其他知情人了解情况，完成调查。4个案调查采用统一的调查表（详见附件：深圳市流感病例个案调查表）。表格填写要完整，不得缺项。5病例调查时，要认真、详细地了解和记录患者发病后到过的地方、乘坐过的交通工具和与其有过密切接触的人员的有关情况。6疑似病例确诊、病人痊愈出院或死亡时，收治病人的医39、疗机构要将病人的诊断、转归情况报告所在地疾病预防控制机构。必要时疾病预防控制机构要进行随访调查。7调查时要注意。（1）对病人及其密切接触者调查时，调查员要按照医务人员接触诊疗人禽流感病人个人防护的有关要求，做好个人防护。（2）调查时要尽量减少对临床诊疗活动的干扰。（二）对接触者的追踪和管理。1接触者的追踪调查。疾病预防控制机构根据个案调查获得的信息，及时开展对病例接触者的追踪和调查。2接触者的医学观察和隔离。（1）如发现密切接触者已出现人禽流感可疑症状时，应立即通知指定医疗机构派专用车辆将其接入指定医院进行隔离诊治，并进行病例个案调查。（2）疾病预防控制机构要根据调查获得的与病例接触的方式、频40、度、场合、场所等详细情况和已经明确的该疾病传播方式和传播特点的有关知识，对接触者受到感染的危险性进行分析和判断，对一般的接触者，要告知注意事项，如有不适，立即到医疗机构就诊；对密切接触者要隔离和医学观察两周（从接触之日算起），隔离期间应及时服用预防药物。 医学观察期满仍未发现续发病例者，应对密切接触者解除医学观察。 3病例、接触者信息的通报。（1）如病例发病后有旅行史，要将病人乘坐过的交通工具的日期、航班、车次、车厢、船舱等详细情况报市级卫生行政部门，由市级卫生行政部门在媒体发布开展对有关班次交通工具乘客的医学观察和追踪调查的信息公告，以便及时发现疫情，迅速采取控制措施。（2）与各地卫生部门之41、间要加强信息沟通，市疾控中心及时将人禽流感和疑似病人患病期间乘坐交通工具的详细情况通报途经和到达各省市的卫生行政部门，共同开展疫情控制和追踪调查工作，同时要将有关情况报告市卫生局。（3）如发现输入病例，由疫情发现地的区级疾病控制部门将其有关流行病学资料报告市疾控中心，由市疾控中心通知病例来源地的相应机构，由来源地负责追踪和调查其密切接触者，并采取相应措施，发现符合诊断标准的，由到达地按规定报告疫情，并进行调查处理。（4）病例的密切接触者已离开疫情发现地，由疫情发现地的区级疾病控制部门报告市疾控中心，由市疾控中心直接通知其目的地的相应机构，由到达地负责追踪调查，并采取相应措施，发现符合诊断标准的42、，由到达地按规定报告疫情，并进行调查处理。（三）疫情处理措施 1、隔离治疗病人： 将病人置于独立的病房中耳语观察治疗；疑似病例与临床病例应分别隔离。 2、病区环境消毒： （1）空气消毒；加强病房通气换气，可用紫外线照射，二氧化氯气溶胶喷雾、过氧乙酸熏蒸或其它消毒方法； （2）地面、物品表面：可用含氯消毒剂擦拭； （3）痰液等分泌物：用含氯消毒剂浸泡。 3、医学观察：对密切接触者进行医学观察2周，有条件者可预防药物进行预防。 4、个人防护： （1）考虑本病通过空气飞沫传播，凡与病人接触者需戴N95口罩。医护人员要注意及时更换新口罩（不超过4小时，最好每次进病房前更换新口罩）。 （2）注意手的清洁43、和消毒。 （3）接触病人后电位酸化水漱口。 （4）医务人员在工作及休息期间尽量减少在院内聚集。 （5）高危人群可考虑药物预防：如服用金刚烷或金刚乙烷或达菲。 5、医疗机构要做好院内感染综合预防控制工作。（四）资料的管理和利用。各级疾病预防控制机构要加强对流行病学资料的分析，及时向同级政府和卫生行政部门报告分析结果，以指导当地疫情控制工作。附表： 深圳市人感染高致病性禽流感个案调查表 编号姓名：性别：年龄：门诊号：住院号：家庭住址：电话：工作单位：职业：发病日期：就诊日期：确诊日期：报告日期：住院日期：出院日期：确诊单位：临床情况：症状与体征：体温、畏寒、头痛、全身酸痛、乏力、胸痛、鼻塞、流鼻涕44、流泪、咽喉痛、咳嗽、恶心、呕吐、咽部充血、眼结膜充血、扁桃体肿大、其它合并症就诊前是否服用过搞病毒药物：是、否临床诊断：实验室检查：白细胞总数：病毒分离结果：血清抗体：急性期，恢复期流行病学调查传染源情况病前三日内去过何处：地点时间当地流感（或疑似）病人：有、无；与病人关系：接触程度：密切、一般；接触日期：疫源地卫生情况住宅情况：家庭、集体宿舍；其它：病人所住房间人数：床间距离：米、头与头距离：米、居住面积：m2/人，开窗情况：，空调使用情况传播途径情况空气飞沫：是、否与病人接触时面对面传播：是、否其它可疑因素：食具、茶具、玩具，其它用品：防疫措施隔离：有、无常通风换气：病人居室（是、否）；45、工作学习场所（是、否）预防接种：疫苗名称，接种日期剂量与用法消毒措施：落实、未落实密切接触者登记三日内与可疑传染源及密切接触者来往登记姓名年龄与患者关系发病日期接触日期地址（单位）诊断小结调查者：调查日期：年月日附件深圳市人感染高致病性禽流感病例报告表报告人： 报告单位（盖章）： 报告日期：序号辖区姓名年龄性别职业现地址单位或学校户籍类型户口所在地发病日期住院日期发热咳嗽胸片或CT实验室检测结果同类病例接触史确诊日期收治单位诊断情况出院情况备注确诊病例疑似病例治愈出院排除出院自行出院注：现住址具体填到区镇村（街道）及具体的门牌号码。学校要注明具体班级。 户籍类型填写：户籍（常住）、暂住或流动。46、附件6：深圳市人感染高致病性禽流感消毒指引 人禽流感是一种新型的从禽到人传播的病毒性传染病，并且有可能发生从人到人的传播。根据该病起病急，传染性较强的特点，为加强人禽流感的预防控制工作，特制定以下消毒措施。 一、消毒药械 （一）空气消毒药械：二氧化氯、过氧乙酸、紫外线灯、循环风紫外线消毒器、臭氧消毒机和静电吸附式空气消毒器以及超低容量喷雾器。 （二）物体表面消毒药械：喷雾型快速消毒药水、二氧化氯、碘伏、含氯消毒剂（漂精粉、强力消洁净、次氯酸钠等）、戊二醛、普通喷雾器、抽真空床单位臭氧消毒器等。 （三）手消毒药剂：手消毒液、碘伏。二、消毒方法 （一）室内空气消毒 1、 保持工作环境与病房的空气流47、通，定期开门窗，自然通风换气，保持空气清新。 2、做好空调送（排）气管道清洁与消毒工作，勤清洁空气过滤设施，安装电子式空气净化机。 3、二氧化氯超低容量喷雾消毒：二氧化氯经加入活化剂后，静置15分钟，稀释至1000mg/L，用超低容量喷雾器进行喷雾消毒（用量：20-25ml/m3 ），消毒后，关闭门窗30分钟以上；也可采用过氧乙酸薰蒸（用量：15%过氧乙酸20 ml/m3 ）作用2小时后，再开门窗通风；或采用过氧乙酸气溶胶（用量：2%过氧乙酸8 ml/m3 ）喷雾消毒，作用1小时。注意消毒场所不得有人员停留。 4、紫外线消毒：紫外线灯空气消毒应采用高强度低臭氧紫外线杀菌灯，室内按每10m2装348、0W紫外线灯一支，照射时间30分钟以上，使用时关闭门窗。注意消毒场所不得有人员停留。 5、臭氧消毒：要求臭氧浓度20mg/m3，在RH70%条件下消毒30分钟以上，消毒时关闭门窗，人必须离开房间，消毒后待房间内闻不到臭氧气味时方可进入（大约在消毒后40分钟左右）。 6、在有人情况下，可采用循环风紫外线空气消毒器或高压静电吸附式空气消毒器对室内空气进行消毒。 （二）物体表面消毒 可用二氧化氯、或喷雾型消毒剂、或含氯消毒剂对物体表面进行擦拭或喷洒消毒。如采用500mg/L的二氧化氯均匀喷洒或擦拭消毒，作用30分钟；用市售喷雾型快速消毒剂则按说明书操作使用。 （三）地面和墙面消毒 配制含有效氯为1049、00mg/L的含氯消毒剂，或500mg/L二氧化氯湿拖，或喷洒墙面与地面。 （四）餐具消毒 病人餐具应单独处理，个人专用。餐具消毒可用煮沸30分钟或用有效氯为500mg/L的含氯消毒剂或二氧化氯浓度为200mg/L的消毒剂溶液浸泡30分钟消毒。 （五）病人衣物消毒 可煮沸消毒或用含有效氯500mg/L的含氯消毒液浸泡30分钟以上。 （六）病人痰液等分泌物、污染物品消毒病人排泄物、分泌物等可用有效氯含量为30000mg/L的含氯消毒液浸泡2-6小时；便器、浴盆的消毒可用有效氯含量为5000mg/L的含氯消毒液浸泡30-60分钟。 （七）病人用具的消毒措施病人用过的枕头、棉被、床垫等可用抽真空床单50、位臭氧消毒器进行消毒。 （八）运送病人的交通工具的消毒 运载病人的交通工具（救护车等）用二氧化氯气溶胶喷雾，用具（担架床等）用含氯消毒剂擦拭。运输工具运输病人时需加强通风。司机和陪同人员须作好个人防护，戴N95口罩，穿防护服，戴一次性乳胶手套。 （九）疫源地消毒实施人员需戴N95口罩、一次性乳胶手套、穿防护服、防水鞋套。附件7：流感样标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输指引 第一部分 采集人群流感大流行期间市、区疾病预防控制中心对不明原因的聚集性发热，职业人群及人禽流感疑似病例，必须及时采样。第二部分 采样准备采样箱准备：（1） 用于采集咽拭子、鼻咽拭子、咽漱液的基本耗材包括：HanK采样51、液；压舌板；无菌棉拭子；50ml螺口塑料管；一次性无菌塑料杯。（2）用于采集血液样本的基本耗材包括：医用（5ml和10ml）一次性注射器；10ml螺口塑料管；止血带；无菌棉拭子；2ml螺口塑料管；碘伏。（3）尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管。（4）记号笔；签字笔；乳胶手套；黄色塑料袋；标本标签；可封性塑料袋；标本采集表格；带有冰袋的冰盒；橡皮筋。采样液配制：常用的采样液有以下五种：普通肉汤、PH7.47.6的Hanks、Eagles、水解乳蛋白液或不加抗菌素的生理盐水（漱喉液）。为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中需加入抗菌素，加入庆大霉素，其终浓度为0.1mg/ml，和抗真菌药物，其终浓52、度为2ug/ml。加入抗菌素以后重新调节PH值为7.4，配制好以后，分装每个采样管4ml，-20冻存。（1） Hanks液配制Nacl 8gKcl 0.4g水 450mlNa2HPO4 0.06gKH2 PO4 0.06 g 葡萄糖 1g水 450ml1酚红 1.6ml 加水定容1000ml， 加压消毒30min ，4Co保存。（2） Eagles溶液的配制 将Eagles粉末9.4克溶于1000 ml去离子水中。 高压灭菌。 厂家：GIBCO 产品：MEM(Eagles) 产品编号：11965084（1000ml）液体（谷氨酰胺，NAHCO3 等）（3）普通肉汤：小牛肉浸膏（牛肉粉） 10克53、牛血清白蛋白 2克蒸馏水加至 400ml庆大霉素（100mg/ml） 0.8ml多粘菌素B （250ug/ml） 3.2ml配制：1）将牛肉粉（牛肉浸膏）溶解350ml蒸馏水后高压灭菌2）将牛血清白蛋白溶解于50ml蒸馏水，无菌过滤。3）庆大霉素（100mg/ml）、多粘菌素B ，无菌水溶解。4）将溶解后的1、2、3、按量混合，分装试管,调PH7.2。（4）双抗溶液(1万单位/ml)的配制： 将青霉素钠粉末(100万单位)4瓶、硫酸链霉素粉末(80万单位)5瓶溶于400 ml无菌双蒸水中。 （5）3谷氨酰胺溶液的配制：将谷胺酰胺3克溶于100 ml双蒸水中。过滤除菌。分装20度保存。 （6）154、%酚红溶液酚红（苯酚红） 1克1N NaOH 不多于7ml去离子水 至100ml1）酚红在乳钵内家少量1N NaOH研磨时期完全溶解，NaOH加的越少越好。2）用去离子水加至100ml3）8磅消毒30min，置4保存。第三部分 采样方法(1)鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子平行于上颚插入鼻孔，保持数秒，待拭子头吸收分泌物以后，缓慢转动推出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头侵入采样液中，尾部弃去。(2)咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部。同样将拭子头侵入采样液中，尾部弃去。注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以提高分离率，减少工作量。(3)鼻咽抽取55、物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液5ml刷洗收集器3次。(4)漱口液：用10ml生理盐水漱喉，漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动5-10次。然后用平皿或烧杯收集洗液。(5)鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔。(6)血清：血清标本采集多用于流感暴发时的血清学核实诊断及人禽流感待查病例的诊断。血清标本采集应该包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早56、采集，可在采集病毒分离标本时同时采集，但不能晚于发病后7天。恢复期血样则在发病后2-4周采集。一般采集空腹血。单份血清不能用作诊断。 取一根至少能装3ml以上，干净和灭过菌的血清采样管做好标记，并进行登记，登记的内容包括：医院名称，患者姓名，性别，急性期或恢复期，采样日期。1）从患者手臂静脉血采2ml，放入准备好的上述血清采样管中。2）然后置室温数小时待血完全凝固。3）15002000rpm离心10分钟，收集血清于1.5ml无菌管中，做好标记。血清可置4存放一周，存放超过一周需置-20或以下保存。（7）尸检组织：病人死亡后应尽早进行解剖，采集肺、气管、肾、脾、肝、心脏、脑、血凝块和淋巴细胞等器57、官标本；每一采集部位分别使用不同消毒器械，避免交叉污染；每种组织应多部位取材，每部位应取20-50g，淋巴结2个，分别置于50ml无菌螺口塑料管中，尸解标本对于病原学研究非常重要，应尽量多采集。立即置于-70以下保存或冷藏送至有关实验室。第四部分 标本的运送新鲜的临床采集标本应在4条件下24小时内运送至对应的流感监测网络实验室。未能24小时内送至实验室的，应置-70或以下保存。标本送至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，24小时内能进行接种的可置于4保存，如未能接种应置于-70或以下保存。临床标本采集管建议使用带螺口的塑料管。第五部分 标本的处理临床采集标本送至实验室后，须经处理后再进行58、病毒分离接种。含聚丙烯纤维的拭子的采集标本，先将含聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出。鼻腔或咽部洗液的标本，充分振荡标本管，将粘液打碎。置4待其自然沉淀510分钟，取上清5ml。上清液可直接接种或低温保存。注：如采样液中尚未加抗菌素，应在接种前补加，用量同上前，混匀后置4过夜或室温作用数小时后可接种。临床标本处理后，将原始标本分为3份，一份（40）用于鸡胚接种，一份（30）用于MDCK细胞接种，一份（30）保存待复核用。对于病毒分离阳性的标本-70保存6个月，在收到国家流感中心或广东省CDC复核鉴定报告后，按照生物安全有关规定处理；病毒分离阴性的标本按生物安全的有关规定处理。第六部分 流感病59、毒株的运输1. 流感毒株的送检要求流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的流感病毒，HA1：8；暴发疫情采样分离到的所有毒株；认真填写流感/人禽流感毒株送检单各项内容；所送检的毒株要求每份3ml，并且无细菌污染。 2. 寄送流感毒株标本的包装、运输 （1）病毒标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧。盖上盖子后不应有泄漏，推荐使用螺口细胞保存管保存和运输流感病毒标本； （2）将密闭后的病毒标本放入大小适合的塑料袋内密封； （3）直接在塑料管上用油性记号笔写明病毒的名称，同时也将病毒标本有关信息填写在送检单内，送检单应单独放在防水的袋子里； （4）将装标本的密封袋放入专用运输箱内（60、或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具防水和缓冲能力的材料；异地运输可以采用邮寄或快递的方法。第七部分 标本的接收 送检的标本（毒株）送到实验室后，由专人在生物安全柜内打开标本的包装。记录收到日期、送检实验室名称、核对并记录送检标本（毒株）编号是否与送检单相同。收到毒株后，及时反馈分型鉴定结果。 附件8流感病毒实验室检验技术指引第一部分：病毒分离MDCK细胞培养技术（一）、生物安全级别和生物安全规定1MDCK细胞培养实验室生物安全级别：生物安全一级或以上。2实验室生物安全规定：（二）、细胞培养的所需材料：生长成片的MDCK细胞 2T-75细胞培养瓶, 颈口有倾角。3D-MEM培养61、液 4青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素 G；10,000 g/ml 硫酸链霉素) ，分装后保存于-20。5HEPES 缓冲液, 1 M 母液。6胎牛血清，40 nm滤过。7EDTA-胰酶 (0.05% 胰酶；0.53 mM EDTA . 4Na)，分装后保存于-208牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液。 91ml 、10ml无菌移液管107075的酒精建议：要求经常检查试剂使用的有效期 （三）、培养基和试剂的准备含L-谷氨酸的完全型D-MEM培养液的准备（用于MDCK培养）500 ml D-MEM液中加入：青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 1062、0 g/ml 链霉素)；HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)；7.5%牛血清白蛋白组分V 12.5 ml。细胞生长液胎牛血清5 ml或小牛血清10 ml 加到 95 ml或90 ml的完全型D-MEM液，使胎牛血清或小牛血清的终浓度分别为5%和10。细胞维持液胎牛血清1 ml或小牛血清2 ml 加到 99 ml或98 ml的完全型D-MEM液，使胎牛血清或小牛血清的终浓度分别为1%和2。细胞接种液：含终浓度为5ug/ml的胰酶的L-谷氨酸的完全型D-MEM培养液。MDCK细胞的培养程序这里以T-75细胞瓶单层培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDC63、K细胞悬液的浓度必须做相应的调整。用于细胞培养的培养基、EDTA胰酶等，37回温后，用7075酒精擦拭后放于生物安全柜内。弃培养液，加5 ml预先37温浴的EDTA-胰酶。温和地摇动细胞瓶1分钟，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA-胰酶。再重新加入5 ml预先37温浴的EDTA-胰酶重复上述步骤。加1 mlEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37孵育细胞瓶直至细胞从塑料表面分离（约510分钟）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。加入1ml牛血清灭活残余的胰酶。加9 ml完全型D-MEM，轻轻上下移动移液管来分散细胞团。取10 ml混合物加到90 ml 细胞生长64、液，该培养液含终浓度为5%的胎牛血清。（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）每个T-25细胞培养瓶加6 ml (600,000 细胞)悬液，剩余的细胞悬液可以加到T-75细胞瓶用于细胞传代。通常6 ml细胞悬液数日可长成成片生长的细胞。于37培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态。注：消化液除EDTA-胰酶外，也可以用0.25%胰酶与Versene 按照1：7的比例配成消化液使用。每批胎牛血清均应进行血清测试，通过测试确定血清的最佳使用浓度。此处提到的血清使用浓度只是一个参考浓度。（四）、细胞的冻存1细胞冻存材料：1）成片的MDCK细胞：细胞生长良好存活率高，8090成片。2）二甲基亚砜（DM65、SO）3) 胎牛血清 4）EDTA-胰酶 (0.05% 胰酶；0.53 mM EDTA. 4Na)，5）移液管：1ml,10ml2. 细胞冻存步骤冻存液的配置配方一：胎牛血清9ml加二甲基亚砜1ml配方二：L-谷氨酸的完全型D-MEM培养液8ml，胎牛血清1ml再加二甲基亚砜1ml。2) 细胞消化,消化过程同细胞培养的消化。3）细胞消化后，加入配置好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。 细胞冻存浓度为11064）细胞冻存过程：4O2小时，-202小时，-70 2小时 放入液氮长期保存。（五）、细胞的复苏：冻存细胞复苏原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，而导致细胞死亡。细胞活化66、后，需要数日或继续传代一至二代，其细胞生长或细胞特性表现才会恢复正常。1材料：37恒温水浴箱细胞生长液 3）T-25培养瓶，无菌移液管4）7075的酒精2.细胞复苏步骤：1）将细胞生长液放入37回温，回温后以7075的酒精擦拭，放入生物安全柜（无菌的操作台）内。2）自液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程盖子容易松掉。3）立即放入37水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1分钟内全部融化，以7075的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜（无菌操作台）。4）取出1.0ml解冻的细胞悬液，缓慢加入有生长液的T-25颈口有倾角细胞培养瓶内，混合均匀，放入培养箱培养。5）次日，更换细胞生长液。67、（六）、质量控制在过量传代的情况下，MDCK细胞可能会失去其对呼吸道病毒的敏感性。因此实验室应保持低代次的细胞株在液氮中。为了保持该分离系统的敏感性，当细胞复苏后被连续传1520代，达到40代以上时，在间隔期可以用已知滴度的阳性质控病毒来检验MDCK细胞系的敏感性。如果细胞的敏感性已经下降，即应复苏新的细胞株。所用细胞系应确保无支原体污染。（七）、MDCK细胞系的敏感性的检测选择已知滴度的阳性质控流感病毒，做101105稀释，取0.5ml分别感染早代的细胞株和现有的细胞株。35天后收获病毒液，检测早代细胞株与现有细胞株培养的病毒液间是否由差别。如有明显差别，表明现有细胞株敏感性已经下降，应重新68、复苏新的细胞株。流感病毒的分离 病毒分离是流感诊断的金标准，也是流感病原学监测的基础。目前，常用鸡胚和MDCK（狗肾细胞）分离培养流感病毒。近年来发现通过鸡胚所分离的流感病毒，其抗原性与原始标本有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒，其抗原性与原始标本相似。另外由于“O”相毒株的重现，MDCK细胞对“O”相毒株的敏感性远高于鸡胚，所以MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。由于MDCK细胞属肿瘤细胞系，用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。因此各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒，而不应放弃鸡胚分离流感病毒的方法。（一）、实验室生物级别和生物安全规定1流感病毒分离69、实验室生物安全级别：生物安全二级流感病毒分离操作必须在生物安全二级实验室的生物安全柜里进行。2实验室生物安全规定应当遵守生物安全二级实验室的有关生物安全的规定（二）、流感病毒的细胞分离标准操作规程1.试验材料和培养基T-25细胞瓶已经75-90成片的MDCK细胞。TPCK处理胰酶（牛胰腺来源型）或0.25%胰酶HEPES 缓冲液, 1 M 母液 青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素 G；10,000 g/ml 硫酸链霉素)细胞生长液细胞接种液处理好的临床样品0.5ml（终浓度为千单位44小时或过夜）T-25培养瓶用于病毒培养。1ml 无菌移液管10ml 无菌移液管2. 流感病毒细胞分70、离程序：所有有关流感病毒分离的操作都应在生物安全实验室中的生物安全柜里进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物安全实验室要遵循生物安全实验室的个人防护要求。 （1）7590成片细胞的准备：用40倍镜观察细胞生长状态。选择处于对数生长期的MDCK细胞用于病毒的分离。轻轻倒出细胞生长液，用6 ml Hanks液分别清洗细胞3遍。（2）细胞培养瓶的接种用无菌的移液管将清洗细胞的Hanks液从细胞培养瓶中移出。用无菌的移液管吸取200 l临床样品置于细胞培养瓶中。37吸附12小时。吸附后清洗细胞后，加入6 ml接种液于细胞培养瓶中。放置于33350C培养箱培养。每日观71、察细胞病变情况。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大。细胞核固缩或破裂。严重时细胞部分或全部脱落）（3）细胞培养物的收获当细胞病变为3+或4+时，即75100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融12次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于第7天收获。进行红细胞凝集试验(HA)，HA8 的进行病毒的鉴定（具体方法参见流感病毒的鉴定技术中的HA试验和HI试验部分）。如没有红细胞凝集现象，继续传代12次。HA试验仍为阴性者，认为MDCK细胞病毒分离阴性，标本按生物安全有关规定进行处理。对于HA8 的细胞分离物继续进行细胞传代，直至HA8 时再进行病毒的鉴定。经连续传代后H72、A8，可以用RT-PCR方法鉴定分型。3）HA8 的细胞分离物的传代方法与标本相同。HA8 进行细胞传代时应将病毒液进行10-110-3稀释后，再感染细胞。具体的稀释浓度与HA的滴度有关。一般滴度小于32时选择10-1倍稀释；滴度大于32以上时选择10-2或10-3稀释。（三）、流感病毒鸡胚分离标准操作规程1.试验材料：911日龄鸡胚青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素 G；10,000 g/ml 硫酸链霉素)70%75酒精一次性注射器器照卵灯鸡蛋开孔蜡或胶水10ml 试管和试管架10ml 移液管和3ml滴管无菌镊子2.流感病毒鸡胚分离程序所有有关病毒分离的操作都应在生物安全实验室生73、物安全柜中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物安全实验室要求遵循生物安全实验室的个人防护要求。（1）验卵用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉。如何判断鸡胚状态血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块胎动：活胚有明显的自然运动，但是大于14天的胎动则不明显；死胚无胎动绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限（2）鸡胚接种将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚,通常每个样本接种23个鸡胚。用70%75酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔74、，开10x6mm裂口。用装上7号针头2.5ml注射器吸1.5ml处理过的临床标本。从裂口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开，此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射200l临床标本。将针头退出至寸，将另外200 l临床标本注入鸡胚尿囊腔。用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚。将针头弃于合适的生物安全装置中。用消毒过的医用胶布或透明胶纸封口。3335温箱培养鸡胚23 天。A型流感病毒培养2天，B型流感病毒培养3天，临床采样标本通常75、培养3天。鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去。提示：禽流感需35或 37培养，哺乳动物流感病毒35培养（禽流感在35时也会生长良好！）（3）鸡胚尿囊液和羊水的收获鸡胚在收获前应4过夜或20至少放置2小时。标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致。用70%75酒精消毒鸡胚顶部。用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以吸少量的尿液冲洗羊膜腔与羊水合并。将鸡胚收获液3000rpm离心5分钟去除血液和细胞。进行红细胞凝集试验76、（具体方法参见流感病毒的鉴定技术中的HA试验部分），HA8 的进行病毒的鉴定。如没有红细胞凝集现象的标本，应再进行鸡胚传代1次（对于“O”相的毒株，需要连续传代多次才能具备在鸡胚中生长的特性）。传代后HA滴度仍为阴性的标本，可以按有关生物安全规定进行处理。对于HA8 的鸡胚分离物继续进行鸡胚传代，直至HA8 时再进行病毒的鉴定。经连续传代后HA8，可以用RT-PCR方法鉴定分型。5）对于HA8的病毒进行鸡胚病毒传代前应将病毒液进行10-110-3稀释。具体的稀释浓度与HA滴度的大小有关。一般滴度小于32时选择10-1稀释度接种；滴度大于32以上时选择10-2或10-3稀释度接种。（四）、注意事77、项1不要在-20条件下保存病毒分离物，因为该温度条件下流感病毒极不稳定。2流感病毒分离操作严格按照生物安全规程的要求。禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床标本和已知标准病毒。禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同动物的标本；动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保存。三、病毒鉴定红细胞凝集和红细胞凝集抑制试验原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现。生物安全要求：生物安全要求及78、个人防护与流感病毒分离相同，并应遵守相应的生物安全规定。实验材料：标准流感病毒参考抗原和抗血清：甲1（H1N1）型、甲3（H3N2）型、B型红细胞悬液（鸡、豚鼠、人）：鸡红细胞悬液终浓度0.5%；豚鼠何人血球终浓度1%磷酸缓冲液(PBS)：0.01M，PH7.2多孔加样器、U型96孔微量板等3. 试验流程:红细胞凝集试验(HA试验)稀释病毒加入配制好的红细胞充分混匀，置室温孵育30-60分钟观察记录结果及判定：血凝效价的判定：能引起红细胞完全凝集时病毒最高稀释度得到数。试验的质量控制加样量准确稀释病毒时吸取液体量准确加过红细胞后，混合均匀室温孵育时间准确，孵育时不要摇动5. 实验步骤：4个凝集79、单位的配制和检测稀释标准参照血清加入25ul 4个血凝单位抗原，室温孵育15-30分钟每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。室温孵育30-60分钟观察记录结果：4个凝集单位的配制：读取红细胞凝集试验的结果计算所须的4个凝集单位的病毒用量用25ul检测4个凝集单位时，用凝集效价除以4；用50ul检测4个凝集单位时，用凝集效价除以8用红细胞凝集试验“回滴”，复核4个凝集单位复核时用25ul，前3孔红细胞完全凝集；用50ul，前4孔完全凝集 。此时的抗原即为4个凝集单位 血清灭活与稀释1份血清与4份RDE，37水浴16h18h后，置56水浴50min常规处理后已成1：5，因此用维持液倍比稀释时，开始80、就为1：10，一般倍比稀释至1：1280。效价读取：血凝抑制效价：完全抑制血凝出现时血清的最高稀释度的倒数 如：某待鉴定病毒对甲3标准血清在1：160时完全抑制，1：320没有完全抑制。此病毒对甲3的抑制效价为160。流感病毒的型别判定：标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价20才可以算为阳性。一个待鉴定病毒不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制待鉴定病毒标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时，可以判定为此性别的流感病毒 质量控制使用的试剂可靠无误处理后的血清有无残余非特异性凝集素读取HA试验的结果是否正确4个血凝单位是否准确红细胞阴性对照待鉴定病毒确保没有81、被细菌污染稀释血清、病毒、红细胞加入量准确流感病毒分离鉴定工作流程图接收传控一部咽拭子标本剩余标本液-80冻存接种MDCK细胞3496h（每日观察CPE）粗血凝阳性接种鸡胚3472h，4过夜收获及粗血凝阴性阳性培养物12120min灭菌弃去HA测定HA测定HI鉴定-80冻存培养液送国家流感中心复检（冷链）培养物12120min灭菌弃去咽拭子标本编号并登记接收反馈结果并存档报告传控一部阴性 第二部分：分血清学以下检测结果任一项阳性均可确诊。红细胞凝集和红细胞凝集抑制试验（参照病毒鉴定）补体结合试验。按GB15994-1995进行。中和试验：中和试验常用的有两种方法，一种为固定病毒量与等量系列倍比82、稀释的血清进行中和试验。另一种为固定血清与等量一系列对数稀释的病毒进行中和试验。流感病毒中和试验可在组织细胞、鸡胚和小鼠身上进行。操作步骤 固定病毒量稀释血清法（以组织培养细胞为例）(一)病毒滴定: 病毒悬液一般以为刚收获的鸡胚尿囊液，HA320，细菌培养阴性，分装,0.5ml/管，-70以下保存 。取出一管化开，用维持液稀释病毒成10-110-8（稀释病毒时，必须每一稀释度换一根吸管），置冰盘上。每稀释度接种4管细胞，0.2ml/管，正常细胞管用0.2ml维持液代替病毒。然后，每管再加维持液0.8ml。细胞感染病毒后，置3335 表7.9.1 病毒在MDCK细胞上的结果病毒稀释度 被感细胞比83、例*10-1 4/4=110-2 4/4=1 10-3 4/4=110-4 4/4=0.510-5 4/4=0.2510-6 4/4=010-7 4/4=010-8 4/4=0*：分母为接种细胞管数，分子为维持液HA阳性的细胞管数用Karber公式：logID50=LD(S0.5)计算。L为病毒滴所用的最低稀释度，表1中为10-1（1）。为每log稀释毒的间距，为1。S为被感染细胞比例之和：1+1+1+0.5+0.25+0+0+0=3.75。代入公式计数结果等于4.25，查反对数表：10-4.25=1：17780=TCID50终点稀释度。实验室用100TCID50单位，即：17780/100=84、177.8，也就是说把病毒悬液进行1：177.8稀释，这样稀释度每0.2ml就含100个TCID50。（二）血清灭活及稀释: 1份血清与4份RDE，37水浴16h18h后，置56水浴50min常规处理后已成1：5，因此用维持液倍比稀释时，开始就为1：10，一般倍比稀释至1：1280。（三） 血清与抗原结合: 0.9ml不同稀释度的血清，各加入0.9ml100个TCID50的病毒，相混，置42h或室温1h。病毒对照为用0.9ml维持液代替血清。血清对照为0.9ml最低稀释度血清加0.9ml维持液，正常细胞对照为仅含维持液。（四）接种细胞: 细胞接种前的处理同病毒滴定相同。每稀释度血清接种4管，085、.4ml/管。接种细胞时，每个血清稀释度换一支吸管或从最低血清稀释度开始往高稀释度顺序加（可用一支吸管），然后每管再补加加0.6ml维持液。置3335孵育72h。（五）结果观察: 同病毒滴定。病毒对照管HA应阳性。血清与正常细胞对照应阴性。（六）50%血清中和终点的计算: 以能保护50%细胞培养管不被感染的最高血清稀释度的倒数作为中和终点。计算公式同上。血清测定结果于表7.9.2。 表7.9.2 血清中和试验结果病毒稀释度 被感细胞比例(1:10)=10-1 4/4=1(1:20)10-1.3 4/4=1 (1:40)10-1.6 4/4=1(1:80)10-1.9 4/4=1(1:160)186、0-2.2 4/4=0.75(1:320)10-2.5 4/4=0.25(1:640)10-2.8 4/4=0(1:1280)10-3.1 4/4=0log50%= 1.00.3（5.00.5）= 2.35查反对数表：10-2.35=1233.9即测定血清的中和滴度为233.9224。第三部分：快速诊断荧光RT-PCR检测方法优势：1.实时性 2.可作到相对和/或绝对定量 3.灵敏度大大提高 4.高通量 5.不需考虑扩增的线形问题和放射性污染 6.无需跑胶和手工收集数据 7.封闭体系中完成,可变因素减少 8.可进行多重PCR反应,不需要后期的数据处理DIRECTIGEN快诊试剂盒（酶免疫法）原87、理：免疫酶染法流程：1.去污剂处理抗原 2.吸附抗原 3.加碱性磷酸酶标记抗核蛋白抗体 4.加底物 显色反应时限：15分钟缺点：无法区分甲型各亚型流感病毒，不能检测乙型流感病毒（具体操作参照产品说明书）胶体金技术: 流感病毒NP蛋白的单克隆抗体，免疫层析,可同时检测A和B流感病毒（具体操作参照产品说明书）四.间接免疫荧光测定法：具体参照（GB15994-1995）第四部分：支持性文件实验室生物安全通用要求 （GB19489-2004）禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法（GB/T19438.1-2004）检测和校准实验室能力的通用要求（GB/T15481-2000）高致病性禽流感防治技术规范88、（GB19442-2004）禽流感病毒NASBA检测方法（GB/19440-2004）流行性感冒诊断标准及处理原则（GB15994-1995）流行性感冒病毒及其实验室技术.郭元吉等著.中国三峡出版社附件9流感监测实验室生物安全规定 流感监测实验室的生物安全基本原则：流感监测实验室均应制定相应的生物安全规定；所有的实验操作均应遵循相关的生物安全规定和实验室基本的操作标准；常规流感检测实验室需要生物安全一级和生物安全二级实验室。（1）正常MDCK细胞的培养需要在生物安全一级或以上实验室里操作；（2）流感监测中的血清标本的检测要求在生物安全一级或以上实验室里进行了；（3）流感病毒的分离鉴定要求在生物89、安全二级实验室里进行，病毒的分离在生物安全二级实验室的生物安全柜里操作。人禽流感检测实验室需要生物安全二级和生物安全三级实验室。（1）人禽流感病毒的分离、鉴定在生物安全三级实验室里进行；（2）血清学检测的血凝抑制试验在生物安全二级实验室里进行，微量中和实验要在生物安全三级实验室进行；（3）进行采样标本的RT-PCR快速检测时，可以在生物安全二级实验室的生物安全柜里提取病毒的核酸，PCR反应和结果检测在二级实验室里进行。无论从事何种试验均应采取相应的个人防护。实验废弃物的处理必须遵守相应的管理规定。应该建立实验室工作人员健康档案。实验室的相关生物安全管理规定：实验室相关的生物安全规定应包括：实验90、室人员的培训、考核制度，实验室的准入制度、实验室的生物安全分区、分级管理规定，良好的微生物学技术，感染物的处理原则，消毒和灭菌，实验室突发事件的处理原则等规章制度。实验室人员的培训、考核实验室生物安全的培训应该包括所有实验室人员（包括实验室临时工作人员以及进修人员），实验室的培训应该包括实验室工作人员的基本知识，可能存在的各种危害以及处理方法，同时应该对实验室人员进行专项知识技能培训。所有的培训都应该对参加培训的人员进行考核，并且这种培训应该是持续的、经常性的。（1）实验室人员应该参加本单位组织的各种生物安全培训并且通过考核； （2）实验室负责人应该组织本实验室人员的基本生物安全培训和专项知识91、技能培训。加强对新进实验室的人员进行全面的培训和原有实验室人员的重点培训。 （3）实验室人员的基本生物安全培训，主要为实验室工作的基本知识、基本技能，可能潜在的危害以及处理方法，以及为保证实验室人员安全建立规范的标准的操作行为和安全意识，每一个实验室人员必须经过此项培训。包括：国家有关传染病防治、病原微生物、生物安全的法律法规和条例。实验室基本操作标准、规范及规章制度，实验室生物安全和个人防护，实验室清洁及消毒方法等。 （4）专项技能培训：主要是针对具体的试验操作而对实验室人员进行的专门培训，包括样品的处理原则，可能的危害以及需要采取的个人防护，仪器设备的正确使用等。 （三） 建立实验室人员准92、入制度： 1. 禁止非工作人员进入实验室，参观实验室等特殊情况须实验室负责人批准后方可进入； 2. 凡是进入实验室并从事检测工作的人员必须经过严格的实验室生物安全和实验操作技术等培训，并取得相应的资格证书； 3. 从事实验室工作必须获得实验室负责人同意，并要接受生物安全员的管理和监督；4. 进入实验室前必须根据实验室的生物安全级别做好相应的个人防护，熟记紧急情况下的正确应对措施；5. 必须熟练掌握实验室装备、技术参数和操作规范；6. 实验室工作人员必须在身体状况良好的情况下，才能进入BSL-2级实验室进行工作。出现下列情况，不应进入上述区域：（1） 身体出现开放性损伤；（2） 患发热性疾病；（93、3） 感冒、上呼吸道感染或其他导致抵抗力下降的情况；（4） 妊娠期间；（5） 已经在BSL-2级实验室连续工作4小时以上或其他原因造成的疲劳状态 7. 16岁以下儿童不应被授权进入实验室工作区。（四） 实验室实行分级、分区管理 1. 生物安全实验室一级（BSL-1） （1） 流感病毒生物安全实验室一级（BSL-1）适用于对实验室工作人员和环境只有潜在危害性小的操作。如用灭活抗原进行血凝抑制试验（HI）检测血清抗体、正常MDCK细胞的培养等试验； （2） 进入BSL-1实验室的工作人员要通过实验室操作程序的特许培训，并由一位受过微生物学及相关培训的实验室工作人员监督管理； （3） 一级生物安全实94、验室不需要特许的一级和二级屏障，除需要洗手池外，依靠标准的微生物操作即可获得基本的防护水平。具体参考实验室生物安全通用要求（GB19489-2004）中的有关规定； 2. 生物安全实验室二级（BSL-2） （1） 流感病毒生物安全实验室二级（BSL-2）适用流感病毒的分离、鉴定，用活病毒进行学凝抑制试验（HI）等实验； （2） 流感病毒的分离要在生物安全二级实验室的生物安全柜里操作。其他能产生感染性气溶胶或溅出物的特定操作程序也需在生物安全柜或其他具有物理防护功能的设备中进行； （3） 进入BSL-2实验室操作流感病毒的实验室工作人员要经过特殊培训并且在资深工作人员的指导下工作； （4） 生物95、安全二级实验室必须在生物安全一级实验室的基础上增加生物安全柜、高压灭菌器，并且实验室设施和个人防护也有更高的要求。具体参考实验室生物安全通用要求（GB19489-2004）中的有关规定； 3. 生物安全实验室三级（BSL-3） （1） 流感生物安全实验室三级（BSL-3）适用于人间高致病性禽流感的病毒分离及相关研究工作； （2） 进入BSL-3级实验室操作高致病性禽流感病毒的实验室工作人员要经过特殊培训，取得相应的资格证书； （3） 生物安全三级实验室除满足BSL-1和BSL-2级实验室设施的要求外，在平面布局、送排风系统等方面有众多的特殊要求，对于个人防护也有更高的要求，具体参考实验室生物安96、全通用要求（GB19489-2004）中的有关规定； （五） 良好的微生物学技术操作规范 1. 严格禁止用嘴吸移液管取液，要使用机械吸液装置； 2. 在实验室里工作始终穿着实验服或工作服，以防止便服被污染； 3. 当实验过程中可能涉及到直接或以外接触血液、有传染性的材料或被感染的动物时必须戴上合适的手套； 4. 用过的手套要在无菌的条件下摘脱，随后必须洗手； 5. 操作活的病原材料后、脱下手套后洗手，离开实验室也要洗手； 6. 工作区内禁止吃东西、喝水、抽烟、操作隐形眼镜及使用化妆品； 7. 所有的实验操作步骤尽可能小心，减少气溶胶或飞溅物的形成； 8. 操作中遇到可能有微生物或其他有毒物质飞97、溅出来时，应佩戴保护性眼罩； 9. 不应在实验室内穿露脚趾的鞋； 10.实验室设备和工作台在处理完感染性标本后，尤其有明显的溢出、飞溅或其他由感染性标本造成的污染时，应该用有效的消毒剂进行常规消毒处理。工作日结束后，应实行终末消毒处理。如有任何潜在危险物溅出时，工作台表面应立即净化消毒处理； 11.针头、注射器或其他尖锐物品应局限在实验室使用。塑料制品可以替代玻璃制品使用。必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。用过的可处理的针头千万不能弯折、剪断、折断、再戴帽或从可处理的注射器上取下以及其他用手的操作；而是必须仔细地放在一个方便放置并且能防止扎伤98、的容器内，这个容器专用于尖锐物品的处理。碎的玻璃制品不能用手直接接触，必须用机械手段如刷子、簸箕、钳子或镊子等取走。盛装污染的针头、尖锐设备和破碎玻璃的容器在处理之前应按照相关规定先进行消毒处理； 12. 液体培养物、组织、标本或具有潜在感染性的废弃物应放在带盖子的容器内，以防止在收集、处理、保存、运送过程中发生泄漏； 13. 所有培养物、贮存病原和其他控制的废弃物在处理之前应使用批准的去除污染方法（如高压灭菌法）进行净化处理。 （六） 实验室废弃物处理规定 1. 感染性生物材料 实验室应有盛装废弃物的容器，最好是防碎裂的，里面盛装适宜的消毒液，消毒液使用时新鲜配制。废弃物应保持和消毒液直接接99、触并根据所使用的消毒剂选择浸泡时间，然后把消毒液及废弃物倒入一个容器里以备高压或焚烧。盛装废弃物的罐子在再次使用前应高压并洗净。 所有感染性材料都应该在防渗漏的容器里高压灭菌，在处理以前，感染性材料装入可高压的黄色塑料袋。高压后，这些材料可放到运输容器以备送至焚烧炉。可重复使用的运输容器应防渗漏，并且有密闭的盖子，这些运输容器在送回实验室重新使用前要消毒并清洗干净。 焚烧是处理污染物的终末最后步骤，污染物的焚烧必须取得公共卫生机构和环卫部门的批准，也要得到实验室生物安全员的批准。 2. 有毒、有害化学物品 （1）强酸、强碱等化学物品必须经过中和反应后，消除其腐蚀性，方可废弃； （2）其它的液体100、废弃物必须经过足够的稀释后，对环境与人体无害后，方可废弃； （3）其中含有有毒、有害化学物品的试验材料在使用后应置于带有明显危险标志的容器内，送至指定地点统一处理。 3. 锐器 （1）使用后的注射针头不应再次使用； （2）完整的注射器应装在防刺透利器盒里，并且不能装满，当装至容积的四分之三时就应放入“感染性材料”容器里拿去焚烧； （3）利器盒不许混入垃圾里； （4）一次性注射器应该放入容器里焚烧，必要时先高压后焚烧。 4. 一般垃圾 办公室垃圾盒确定没有生物和化学危害的垃圾可以作为一般垃圾进行处理，处理时应该按照分类处理的原则，分为可分解的废弃物如纸张等和不可分解的废弃物如玻璃金属等。 （七）101、 意外事故处理办法（记录、报告）及应急预案 1. 意外事故应急处理方案 实验室所有电话机旁的显著位置均应至少有下列电话号码和地址：本实验室负责人、生物安全员、安全保卫部门、消防部门、医疗急救部门等； 发生实验室意外和事故后，应及时通知实验室安全员和实验室负责人，并做好详细记录备查； 制定实验室有毒有害化学品、感染性材料溢出时的应急处理方案，实验室人员意外损伤的处理措施； 实验室应备好急救箱，并且应该告知每个人。 2. 工作人员意外感染 当实验室人员从事高致病性禽流感工作时，如果出现流感样症状或者肺炎症状，要及时报告实验室负责人，并且立即停止工作。实验室负责人应该立即向所在单位生物安全委员会报告102、。并且立即送当地定点收治医院 ，置单间治疗，采取相应的院内感染控制措施，直至病例排除为止。 （八） 实验室消毒和灭菌 消毒是指杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽孢的细菌和非病原微生物。一般消毒剂在常用的浓度下，只对细菌的繁殖体有效，对其芽孢则需要提高消毒剂的浓度和延长作用的时间。 灭菌是指杀灭物体上所有微生物的方法。因此，灭菌比消毒的要求高，包括杀灭病原微生物和非病原微生物、细菌的繁殖体和芽孢。应根据实验工作的类型及所操作的感染性因子的性质选择适当的消毒或灭菌方法。 实验室的消毒和灭菌应由监督员督促值日生或实验者在试验前、实验期间和实验后对各种物品和操作环节进行消毒或灭菌，防止微生103、物的扩散和感染性疾病传播、保证相关实验的无菌环境。 消毒和灭菌的效果与实验室基础设施和试验微生物的特性密切相关，须根据实验特点选择一定生物安全级别的实验室开展试验并严格按规程操作；实验室的相关人员必须经过消毒和灭菌知识培训后才能上岗。在生物安全操作、个人防护和生物性废弃物的处理等方面都涉及消毒和灭菌问题，实验室应针对这些工作的要求制定具体的消毒和灭菌方法和程序。 （九）流感实验室检测中应注意的问题A.禁止在同一实验室，更不应在同一接种柜中，同时处理接种未知临床标本和已知阳性标本。 B.禁止在同一实验室，同一时间处理，接种采自不同动物的标本；动物标本（如禽、猪等）必须与人的标本分别保存。 C.接104、种后剩余原始标本，尤其分离出病毒的标本需暂时冻存，有条件的应置-70或以下保存，以便需要时可进行复查。 D.严禁实验室交叉污染：在病毒分离时严禁设阳性对照及操作人群中已消失的流感病毒。 E.流感病毒在-20-40时不稳定，故不宜在此温度下长期保存。F.鸡胚中分离出的流感病毒，应尽量别在MDCK细胞上传代。因当今国内所用的MDCK细胞属肿瘤细胞系，一旦病毒通过它传代就无法用于疫苗制备。附 禽流感职业暴露人员防护指导原则1.防护用品禽流感职业暴露人员使用的防护用品应符合国家的有关标准。（1）防护服：一次性使用的防护服应符合医用一次性防护服技术要求GB19082-2003。（2）防护口罩：应符合医用105、防护口罩技术要求GB19083-2003。（3）防护眼镜：视野宽阔，透亮度好，有较好的防溅性能，弹力带佩戴。（4）手套：医用一次性乳胶手套或橡胶手套。（5）鞋套：为防水、防污染鞋套。（6）长筒胶鞋。（7）医用工作服。（8）医用工作帽。2.防护用品的穿脱顺序 A.穿戴防护用品顺序步骤1 戴口罩，一只手托着口罩，扣于面部适当的部位，另一只手将口罩带戴在合适的部位，压紧鼻夹，紧贴手鼻梁处。在此过程中，双手不接触面部任何部位。步骤2 戴帽子，戴帽子时，注意双手不接触面部。步骤3 穿防护服。步骤4 戴上防护眼镜，注意双手不接触面部。步骤5 套上鞋套。步骤6 戴上手套，将手套套在防护服袖口外面。B.脱掉防106、护用品顺序步骤1 摘下防护镜步骤2 脱掉防护服，将反面朝外，放入黄色塑料袋中。步骤3 摘掉手套，将反面朝外，放入黄色塑料袋中。步骤4 将手指反掏进帽子，将帽子轻轻在下，将反面朝外，放入黄色塑料袋中。步骤5 脱下鞋套，将反面朝外，放入黄色塑料袋中。步骤6 摘掉口罩，一手按住口罩，另一只手将口罩带摘下，注意双手不接触面部。3.分级防护原则各级医务人员、疾病预防控制机构及其他有关人员在医院或疫点、疫区进行禽流感防治工作时，应遵循以下防护原则：（1）一级防护A.适用范围 对禽流感疑似或确诊病例的密切接触者及病死禽的密切接触者进行医学观察和流行病学调查的人员。对疫点周围3公里范围内（疫点除外）的家禽进行107、捕杀和无害化处理及对禽舍和其它场所进行预防性消毒的人员。B.防护要求戴16层棉纱口罩（使用四小时后，消毒更换），穿工作服，戴工作帽和乳胶手套。对疫点周围3公里范围内的家禽宰杀和无害化处理，进行预防性消毒的人员还应戴防护眼镜、穿长筒胶鞋、带橡胶手套 。每次实施防治处理后，应立即进行手清洗和消毒。（2）二级防护 A.适用范围进入医院污染区的人员；采集疑似病例、确诊病例咽拭子的人员；处理其分泌物、排泄物的人员；处理病人使用过的物品和死亡病人尸体的人员以及转运病人的医务人员和司机。对禽流感疑似或确诊病例进行流行病学调查的人员。在疫点内对禽流感染疫动物进行标本采集、捕杀和无害化处理以及进行终末消毒的人员108、。B.防护要求穿普通工作服、戴工作帽、外罩一层防护服、戴防护眼镜和防护口罩（离开污染区后更换），戴乳胶手套、穿鞋套。进行家禽的宰杀和处理时，应戴橡胶手套，穿长筒胶鞋。每次实施防治处理后应立即进行手清洗和消毒，方法同一级防护。（3）三级防护A.适用范围 确定禽流感可由人传染人时，对病人实施近距离治疗操作例如气管插管、气管切开的医务人员。B.防护要求除按二级防护要求外，将口罩、防护眼镜换为全面型呼吸防护器（符合N95或FFP2级标准的滤料）。4.对手清洗和消毒的要求和方法（1）对洗手的要求A.接触确诊禽流感病人和疑似病人后。B.接触血液、体液、排泄物、分泌物和被污染的物品后。C.进入和离开隔离病房109、穿戴防护用品前、脱掉防护用品后。D.在同一病人身上，从污染操作转为清洁操作之间。E戴手套之前，摘手套之后。（2）对手消毒的要求A.接触每例确诊禽流感病人和疑似病人之后。B.接触感染的伤口和血液、体液、排泄物和分泌物之后。C.离开隔离病房、ICU等污染区域脱掉防护用品后。D.接触被禽流感病毒污染的物品之后。（3）标准洗手方法（）掌心对掌心搓擦；（）手指交错掌心对手背搓擦（）手指交错掌心对掌心搓擦（）两手互握互搓指背 （）拇指在掌中转动搓擦（）指尖在掌心中搓擦（4）手消毒的方法手消毒可用0.30.5%碘伏消毒液或快速手消毒剂（异丙醇类、洗必泰-醇、新洁尔灭-醇、75%酒精等消毒剂）揉搓作用13分钟。